辣木葉總黃酮對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎防治作用的研究

彭偉龍，HOSAMELDEEN Mohamed Husien,2，伯若楠，劉明江，楊海峰，李金貴

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省高校動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同中心，揚(yáng)州 225009；2.布爾塔那大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，Rufaa 999129；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發(fā)生在人、犬、貓等物種中的非特異性、復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎癥疾病[1]。由于高脂飲食和不規(guī)律的生活作息，UC在發(fā)達(dá)國家人群發(fā)病率超過0.3%[2-3]，據(jù)統(tǒng)計，近三十年中國UC發(fā)病率增加了近3倍[4]。目前UC的病因尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為其發(fā)病原因是基因、腸道菌群、宿主免疫和環(huán)境等多種因素造成的[5]。王瑞生等[6]研究表明，UC發(fā)病機(jī)制與腸屏障功能障礙和免疫異常密切相關(guān)。當(dāng)腸黏膜屏障受損，腸道內(nèi)有害菌及其代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素(LPS)進(jìn)入血液，加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)，上調(diào)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)等促炎因子的表達(dá)，此類因子激活后可與相應(yīng)腸上皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)引起腸上皮細(xì)胞的異常凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜相關(guān)細(xì)胞數(shù)量變少[7]。同時，閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)和閉合蛋白(Occludin)等緊密連接蛋白與腸上皮細(xì)胞是腸黏膜屏障的關(guān)鍵組成部分，當(dāng)腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少時，緊密連接蛋白分泌量下降[8]，進(jìn)而導(dǎo)致腸屏障功能障礙。這提示針對炎性因子和腸黏膜屏障進(jìn)行干預(yù)是防治UC的有效靶點(diǎn)。

辣木(Moringaoleifera)原產(chǎn)于印度，于2012年被中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)認(rèn)定為新資源食品，也是中國藥食兩用的食品資源，與靈芝和西洋參并稱“世界三寶”[9]，近年來大面積種植于中國云南地區(qū)。辣木葉在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中主要用作消炎止痛藥物，辣木葉膏藥在印度被用來治療腮腺炎[10]，其水提取物在角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹模型中有顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛效果[11]。辣木葉中的主要活性成分是硫苷和黃酮[12]，并且黃酮類成分發(fā)揮著顯著的抗炎效果[13]，但辣木葉對腸炎的防治效果卻鮮有報道。本試驗(yàn)以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠為模型，提取辣木葉總黃酮(Moringaoleiferaleaf flavonoids，MOLF)作為防治藥物，通過對小鼠一般癥狀觀察、測定血清與組織中炎性因子含量、檢測腸黏膜蛋白表達(dá)量和腸上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況來綜合評估MOLF對UC小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)和腸黏膜屏障的改善效果，為MOLF的進(jìn)一步開發(fā)利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 MOLF的制備

辣木葉購自云南寧澤生物科技有限公司，取干燥辣木葉100 g研磨粉碎，石油醚40 ℃回流8 h，過濾后的辣木葉粉60 ℃烘干1 h后加入70%乙醇，料液比20∶1，超聲功率300 W，提取時間25 min，提取液濾過后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，除去蛋白質(zhì)、多糖等水溶性雜質(zhì)，冷凍干燥48 h得MOLF。經(jīng)大孔樹脂分離純化后以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)法測得MOLF含量為32.7 mg/g，配制成25、50、100 mg/kg MOLF提取液備用。

1.2 試驗(yàn)動物與處理

1.2.1 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理 體重為(20±2)g清潔級雄性BALB/c小鼠50只，購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SYXK[蘇]2017-0044，試驗(yàn)過程中小鼠均飼喂專用鼠糧(購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)，自由采食與飲水，環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對濕度為(60±10)%。試驗(yàn)程序均符合揚(yáng)州大學(xué)動物福利委員會的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 試驗(yàn)動物分組與處理 試驗(yàn)小鼠稱重并隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為對照組(control)、DSS組(模型組)、MOLF-L組(25 mg/kg)、MOLF-M組(50 mg/kg)、MOLF-H組(100 mg/kg)。小鼠連續(xù)7 d自由飲用4% DSS(W/V)誘導(dǎo)UC模型，期間藥物處理組每天1次灌服0.2 mL不同濃度的MOLF提取液，對照組和模型組灌服無菌生理鹽水給予相同刺激。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DSS(MW：36000-50000)購自MP Biomedicals公司；PAS染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1 ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；LPS檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技有限公司；抗體ZO-1(40-2200)、Occludin(40-4700)均購自Invitrogen公司；Cleaved-caspase 3(Asp175，9661)、Bcl-2(3498)、Bax(2772)、β-actin(4970)均購自CST公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗和Cy3標(biāo)記山羊抗兔二抗均購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 主要儀器 石蠟切片機(jī)(RM2125RTS)和正置熒光顯微鏡(DM2500)均購自Leica公司；Epoch 酶標(biāo)儀購自Biotak公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；ChemiScope化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 小鼠體重變化、疾病活動指數(shù)(DAI)評分與結(jié)腸長度的測定 每天在小鼠進(jìn)行藥物處理前稱重，計算末次給藥前體重與初始體重的比值，得到小鼠平均體重變化率(%)；每天觀察小鼠的糞便黏稠程度并用聯(lián)苯胺冰醋酸法檢測糞便是否隱血或者帶血，進(jìn)行DAI評分(DAI評分是對動物體重減輕情況、糞便黏稠度和直腸出血情況的綜合評價，通常作為評估結(jié)腸炎患者臨床進(jìn)展的指標(biāo)[14])，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。試驗(yàn)結(jié)束后用脫頸椎的方式處死小鼠，剪取距盲腸0.5 cm至距肛門1 cm處完整的結(jié)腸并測量其長度。

表1 疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The criterion for judgement of disease activity index

1.4.2 組織病理學(xué)觀察 取小鼠結(jié)腸組織，在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，再經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、修蠟、切片，一部分經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下拍照觀察；另一部分按照PAS染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，中性樹膠封固后置于顯微鏡下觀察。

1.4.3 血清中IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1和LPS含量 處死小鼠前從眼眶靜脈叢采集血液，在室溫條件下自然凝固10～20 min，4 ℃、3000 r/min離心10 min，收集上清，采用ELISA方法測定小鼠血清中IL-1β、IL-10、TNF-α、HMGB1含量，使用鱟試劑盒(試管定量顯色基質(zhì)法)檢測小鼠血清中LPS含量。

1.4.4 結(jié)腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α和HMGB1 mRNA表達(dá)水平 剪取100 mg凍存的結(jié)腸組織置于EP管中，采用Trizol試劑提取總RNA,調(diào)整濃度至75 μg/μL。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，以其為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。按照熒光定量試劑盒說明書預(yù)混20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.4.5 結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin表達(dá)水平測定 利用免疫熒光法檢測小鼠結(jié)腸中ZO-1和Occludin表達(dá)水平。取固定的小鼠結(jié)腸組織樣本制備冰凍切片，脫蠟后使用修復(fù)液(枸櫞酸緩沖液，pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)，5% BSA 37 ℃封閉1 h，對不同組織切片滴加稀釋后的一抗ZO-1(1∶100)和Occludin(1∶100)，4 ℃孵育過夜，次日加入綠色熒光標(biāo)記二抗(1∶200)和紅色熒光標(biāo)記二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育2 h；最后DAPI染核5 min，封片后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.6 腸上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量檢測 將組織剪碎后加入裂解液裂解，充分勻漿后離心收集上清液，以BCA定量法測定上清液蛋白濃度，然后將上清液置于沸水中10 min使蛋白變性，取10 μL液體進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別使用Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育；加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBST洗3遍后使用ECL顯影檢測蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Graphpad 8.0.2軟件統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MOLF對UC小鼠體重、疾病活動指數(shù)和結(jié)腸長度的影響

由表3可知，在試驗(yàn)結(jié)束時，除對照組小鼠體重穩(wěn)定增加外，DSS組小鼠體重較初始體重明顯降低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；MOLF-M和MOLF-H組小鼠體重接近于初始體重，體重變化率均顯著高于DSS組(P<0.05)。

同時，除對照組小鼠DAI指數(shù)始終處于低水平外，其他組小鼠DAI指數(shù)均有不同程度增加，尤其是DSS組小鼠DAI評分極顯著高于對照組(P<0.01)；MOLF處理降低了DSS誘導(dǎo)的DAI評分，其中MOLF-H組的DAI評分與DSS組相比差異極顯著(P<0.01)。

剖檢發(fā)現(xiàn)，DSS組小鼠的結(jié)腸發(fā)生明顯萎縮，長度極顯著低于對照組(P<0.01)；相較于DSS組，MOLF處理后小鼠結(jié)腸長度得到明顯改善，尤其是MOLF-M和MOLF-H組的結(jié)腸長度極顯著增加(P<0.01)。

表3 各組小鼠平均體重變化率、疾病活動指數(shù)和結(jié)腸長度Table 3 Average weight change rate,DAI and colon length of UC mice in each group

2.2 MOLF對小鼠結(jié)腸組織病變和杯狀細(xì)胞數(shù)量及其形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1A可知，對照組結(jié)腸組織未觀察到明顯壞死，其黏膜上皮結(jié)構(gòu)和腸隱窩等結(jié)構(gòu)完整，中性粒細(xì)胞呈散在性分布。DSS組小鼠黏膜下層明顯水腫(▲所示位置)，腸隱窩結(jié)構(gòu)被破壞、變形、排序紊亂，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(※所示位置)，少數(shù)可達(dá)肌層，并伴有上皮細(xì)胞壞死和脫落；MOLF-L組肌層出現(xiàn)水腫，有較多炎性細(xì)胞浸潤，腸隱窩結(jié)構(gòu)不規(guī)則；MOLF-M組腸腺結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛形態(tài)完整，少量中性粒細(xì)胞浸潤；MOLF-H組腺體層次清晰可見，固有層結(jié)構(gòu)正常，肌層也無明顯異常。

由圖1B可知，對照組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)量充足，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；DSS組杯狀細(xì)胞數(shù)量極少(→所示位置)，形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)；與DSS組相比，MOLF-L組杯狀細(xì)胞數(shù)量較少并呈無規(guī)則分布；MOLF-M組杯狀細(xì)胞數(shù)量較多且形態(tài)得到改善；MOLF-H組杯狀細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)接近對照組，數(shù)量較多且分布均勻。

2.3 MOLF對小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1和LPS含量的影響

由表4可知，與對照組相比，DSS組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均極顯著上升(P<0.01)，IL-10含量極顯著降低(P<0.01)；與DSS組相比，MOLF-M組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均顯著下降(P<0.05)，MOLF-H組IL-1β、TNF-α、HMGB1和LPS含量均極顯著降低(P<0.01)，MOLF-M和MOLF-H組IL-10含量均極顯著增加(P<0.01)。

2.4 MOLF對小鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量的影響

由表5可知，與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA相對表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，IL-10 mRNA的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與DSS組相比，MOLF-M組IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，MOLF-H組IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，IL-10 mRNA的表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01)。

A，小鼠結(jié)腸HE染色圖；B，小鼠結(jié)腸PAS染色圖 A，HE staining of mice colon；B，PAS staining of mice colon圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察Fig.1 Histopathological observation of colon in mice of each group

表4 各組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1和LPS水平Table 4 Serum levels of IL-1β,TNF-α,IL-10,HMGB1 and LPS in mice of each group

表5 各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1 mRNA表達(dá)量Table 5 The mRNA expression of IL-1β,TNF-α,IL-10 and HMGB1 of colon in mice of each group

2.5 MOLF對小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin表達(dá)水平的影響

免疫熒光檢測獲得了較為直觀的蛋白表達(dá)結(jié)果，見圖2。由圖2可知，與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸中ZO-1和Occludin熒光強(qiáng)度降低；經(jīng)MOLF處理后ZO-1和Occludin熒光強(qiáng)度增加，其中MOLF-H組接近對照組。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織免疫熒光染色(100×)Fig.2 Immunofluorescence staining of colon in mice of each group (100×)

2.6 MOLF對小鼠結(jié)腸組織中cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織中cleaved-caspase 3的表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；與DSS組相比，隨著MOLF濃度的增加，小鼠結(jié)腸組織中cleaved-caspase 3的表達(dá)顯著或極顯著下降(P<0.05；P<0.01)；同時，在DSS的刺激下，小鼠結(jié)腸組織中的Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)增加，與對照組差異極顯著(P<0.01)；相比于DSS組，MOLF-H處理極顯著緩解了Bcl-2表達(dá)下降和Bax表達(dá)增加(P<0.01)。

3 討 論

辣木葉中的黃酮類化合物已被證實(shí)在緩解氧化應(yīng)激和抗炎方面發(fā)揮重要作用[15]，本試驗(yàn)利用DSS建立UC模型，該模型效果明顯，臨床癥狀與病理學(xué)改變與人體潰瘍性結(jié)腸炎類似，適用于針對潰瘍性結(jié)腸炎藥物作用的研究[16]，并且DSS對腸上皮細(xì)胞有直接毒性，會破壞腸黏膜屏障的完整性[17]，適合用于研究藥物對腸黏膜屏障修復(fù)的保護(hù)機(jī)制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠DAI指數(shù)明顯高于對照組，并伴有腹瀉、血便黏連、體重急劇下降、結(jié)腸明顯縮短等UC典型的臨床癥狀，證明成功誘導(dǎo)出UC模型，效果明顯。并且MOLF可以顯著緩解UC小鼠體重減輕狀況，改善DAI評分，抑制結(jié)腸縮短。對結(jié)腸組織進(jìn)行病理組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MOLF可以改善DSS誘導(dǎo)的腸結(jié)構(gòu)破壞、杯狀細(xì)胞減少和炎性細(xì)胞浸潤情況，這些結(jié)果都表明MOLF對UC臨床癥狀和結(jié)腸病理變化具有良好的改善效果。

炎性細(xì)胞因子在UC發(fā)病過程中扮演著重要角色，當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時，腸黏膜的免疫功能受到破壞，使腸道內(nèi)條件致病菌容易在腸道內(nèi)定植并產(chǎn)生毒素[18]，有害菌及其代謝產(chǎn)物如LPS等會進(jìn)入血液[19]，造成單核細(xì)胞與常駐肥大細(xì)胞的額外募集，刺激促炎和促纖維化介質(zhì)IL-1β、TNF-α、HMGB1等因子的產(chǎn)生[20-21]，進(jìn)而通過多種途徑引起機(jī)體局部乃至全身炎癥反應(yīng)。本研究通過對小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1炎癥因子和LPS檢測發(fā)現(xiàn)，MOLF會明顯抑制促炎因子的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子，降低血清中LPS水平。同時用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，MOLF處理會顯著降低促炎因子IL-1β、TNF-α和HMGB1 mRNA的表達(dá)，增加抗炎因子IL-10 mRNA的表達(dá)。

A、B，分別為Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白Western blotting條帶圖；C、D、E，分別為Cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量 A and B，Western blotting strip charts of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax proteins；C，D and E，Protein expression levels of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax圖3 各組小鼠結(jié)腸組織cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量Fig.3 Expression of cleaved-caspase 3,Bcl-2 and Bax proteins in colon of mice in each group

緊密連接作為腸黏膜機(jī)械屏障的核心結(jié)構(gòu)，廣泛存在于相鄰的腸上皮細(xì)胞之間[22]，其中ZO-1和Occludin等蛋白共同組成緊密連接的主體，完整的緊密連接結(jié)構(gòu)可封閉細(xì)胞間隙，防止有害物質(zhì)侵襲，對維持腸黏膜屏障完整性發(fā)揮重要的作用[23]。本研究通過免疫熒光試驗(yàn)檢測ZO-1和Occludin的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin熒光強(qiáng)度明顯降低，提示緊密連接關(guān)鍵蛋白低表達(dá)可能是UC發(fā)生的關(guān)鍵因素之一；MOLF處理則減輕了DSS誘導(dǎo)損傷導(dǎo)致的緊密連接關(guān)鍵蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)降低。此外，緊密連接還有固定上皮細(xì)胞維持細(xì)胞間極性的作用，正常生理情況下，腸上皮細(xì)胞中的Bcl-2和Bax蛋白以適當(dāng)?shù)谋壤嬖?，兩者功能相反，若Bax占優(yōu)勢，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；若Bcl-2占優(yōu)勢，則抑制細(xì)胞凋亡[24]。當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時，Bax表達(dá)增多，形成的Bax/Bax同二聚體增加，使線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致caspase家族蛋白被激活，特別是caspase 3[25]。本研究結(jié)果表明，MOLF處理可以顯著增加UC小鼠結(jié)腸中Bcl-2的表達(dá)，同時降低cleaved-caspase 3和Bax的表達(dá)，高劑量組效果最明顯。這提示MOLF保護(hù)UC的機(jī)制可能與其維護(hù)腸緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)、調(diào)控腸上皮細(xì)胞凋亡cleaved-caspase 3/Bcl-2/Bax信號通路有關(guān)，從而達(dá)到防治UC的作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠UC模型中，MOLF可以明顯緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸長度縮短、血清和組織中促炎因子水平升高、腸黏膜緊密連接蛋白損失，并抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮預(yù)防保護(hù)作用，其中以100 mg/kg MOLF處理效果最好。本研究可為辣木的開發(fā)利用以及MOLF防治UC提供新的思路。