豬流行性腹瀉病毒S2基因B細(xì)胞表位嵌入型S-層蛋白在副干酪乳桿菌中的表達(dá)與鑒定

白偉琴，卡楚拉，烏志勇，苗 苗,塔 娜，格日勒?qǐng)D

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010010)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種較常見(jiàn)的、侵染性較高的、具有包膜結(jié)構(gòu)的、單股正鏈RNA病毒，屬于α冠狀病毒屬[1-2]。基因組全長(zhǎng)約28 kb，可編碼4種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小膜蛋白(E)[3]。其中，S蛋白屬于一種Ⅰ型糖蛋白，分布在病毒粒子最外層，與其他冠狀病毒S蛋白一樣，PEDV S蛋白也是定位于病毒粒子表面的一種二聚體結(jié)構(gòu)糖蛋白，在調(diào)節(jié)特定宿主細(xì)胞受體糖蛋白的相互作用、病原體侵入宿主細(xì)胞后的介導(dǎo)及刺激自然宿主誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。在表位疫苗的研究中選定能與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(MHCⅡ)有效匹配的肽序列尤為重要，因?yàn)镸HCⅡ-Ag易向輔助T細(xì)胞遞呈抗原，從而有望觸發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫兼?zhèn)涞拿庖邞?yīng)答，因此選擇S2基因B細(xì)胞表位(EpitopeS2)作為靶位序列。

副干酪乳桿菌作為一種常見(jiàn)的食品級(jí)微生物，在乳制品、飲料及保健食品中均能分離到，并在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5]。利用非致病性和侵襲性的副干酪乳桿菌作為抗原傳遞載體應(yīng)用于疫苗研究領(lǐng)域，不僅能發(fā)揮乳酸菌本身的益生作用，還能避免制備純化病毒抗原的繁瑣流程，并有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6]。乳酸菌S-層蛋白(S-layer protein，SLP)是蛋白質(zhì)狀的細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)[7]，可作為外部顯示的輔助蛋白和糖蛋白[8]，其作為融合蛋白還具備以下特點(diǎn)：首先，SLP是乳酸菌的特殊結(jié)構(gòu)，能在菌體表面組裝成納米級(jí)晶格結(jié)構(gòu)，將抗原表位嵌入到這些晶格中更有利于病毒抗原與宿主相關(guān)細(xì)胞接觸形成有效刺激[9]；其次，SLP具有增加宿主細(xì)菌黏附作用，可有效延遲細(xì)菌在腸道中滯留時(shí)間[10]。被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建S-層融合蛋白，在人或動(dòng)物的免疫接種中應(yīng)用。為更好地觸發(fā)免疫應(yīng)答，將EpitopeS2基因嵌入到乳酸菌SLP基因序列中構(gòu)建融合基因SLP-EpitopeS2，利用SLP的佐劑效應(yīng)使得表位肽更好地發(fā)揮作用。

本研究將SLP-EpitopeS2融合基因克隆到表達(dá)載體pTRK892中構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其電轉(zhuǎn)化至副干酪乳桿菌構(gòu)建重組副干酪乳桿菌來(lái)表達(dá)EpitopeS2抗原蛋白，以期為PEDV新型活菌載體疫苗相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 副干酪乳桿菌由本實(shí)驗(yàn)室從傳統(tǒng)馬奶酒中分離并保存；重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitpeS2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存[11]；大腸桿菌MC1061菌株、乳桿菌表達(dá)載體pTRK892均購(gòu)自Addgene公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體(McAb)委托吉爾生化(上海)有限公司制備；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

SDS-PAGE電泳儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitopeS2基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：F：5′-GCTGAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCT-ATGAAGAAAAATTTAAGAATCGTTAGCGC-TG-3′；R：5′-AGAGCGGCCGCTTATCTAAAGT-TTGCAACCTTAAC-3′，下劃線處分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2的構(gòu)建及鑒定 利用上述合成的引物，以重組質(zhì)粒pGEX-SLP-EpitopeS2為模板PCR擴(kuò)增SLP-EpitopeS2融合基因，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因，將目的基因與經(jīng)相同酶切處理的pTRK892表達(dá)載體用T4 DNA連接酶4 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞，從含有1.5%紅霉素(Em)的LB瓊脂培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.3 重組副干酪乳桿菌的構(gòu)建及鑒定 將副干酪乳桿菌制備為副干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2與副干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合冰浴5 min，將混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)完成后添加800 μL含有0.500 mol/L蔗糖、0.020 mol/L MgCl2和0.005 mol/L CaCl2的MRS液體培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，37 ℃培養(yǎng)3 h。將200 μL細(xì)菌懸浮液均勻涂布于含有0.2%紅霉素的MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，直至形成單個(gè)菌落，將單個(gè)菌落接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基(Em+)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定正確的重組副干酪乳桿菌菌液與 50%甘油1∶1混合，-80 ℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達(dá) 將pTRK-SLP-EpitopeS2菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，二代菌以1∶100(V/V)接種于MRS液體培養(yǎng)基(Em+)中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h進(jìn)行蛋白表達(dá)。取1 mL菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、5 000×g離心10 min。沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入50 μL 1×SDS上樣緩沖液重懸沉淀，100 ℃煮沸5 min變性，冰浴5 min，12 000×g離心10 min，取20 μL蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，考馬斯亮藍(lán)染色脫色液脫色1～2 h，觀察是否有目的蛋白。

1.2.5 Western blotting 鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達(dá) SDS-PAGE結(jié)束后，將蛋白凝膠通過(guò)半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，然后將NC膜于PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體(1∶500稀釋)中4 ℃ 孵育過(guò)夜，次日NC膜用含0.05% Tween的PBST洗滌3次，每次10 min，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。洗滌完后用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色觀察。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定 將載玻片用多聚賴氨酸處理30 min，并將D600 nm值約為1.0的重組副干酪乳桿菌(含pTRK-SLP-EpitopeS2質(zhì)粒)和對(duì)照副干酪乳桿菌(不含質(zhì)粒)用4%多聚甲醛固定在載玻片上，在1∶100稀釋的PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體中避光孵育45 min，用PBS洗滌2次后，樣品在1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體中避光孵育30 min，并用PBS洗滌3次，然后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照記錄。

1.2.7 重組副干酪乳桿菌膜蛋白提取及鑒定 參考尹瓊芳等[12]氯化鋰(LiCl)提取SLP的方法,將擴(kuò)大培養(yǎng)的重組副干酪乳桿菌菌液分裝至50 mL離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次，用8 mL 4 mol/L 的LiCl重懸菌沉淀，室溫?fù)u床孵育1 h，孵育結(jié)束后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清。上清液于0.01 mol/L PBS(pH 7.4)中4 ℃透析，用聚乙二醇濃縮蛋白樣品溶液，取少量蛋白用1.2.4和1.2.5的方法分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2 PCR鑒定結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出大小為1 400 bp的條帶，與插入的SLP-EpitopeS2融合基因大小一致；EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示，獲得大小分別為1 400 和4 700 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，不存在堿基缺失和基因突變，表明重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2構(gòu)建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1，重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2，陰性對(duì)照；M2，DL5000 DNA Marker；3，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 M1，DL2000 DNA Marker；1，PCR product of recombinant plasmid；2，Negative control；M2，DL5000 DNA Marker；3，Double enzyme digestion products of recombinant plasmid圖1 重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of recombinant plasmid pTRK-SLP-EpitopeS2

2.2 重組副干酪乳桿菌鑒定結(jié)果

經(jīng)電轉(zhuǎn)化得到的單菌落稀釋后進(jìn)行 PCR 鑒定，在1 400 bp 處出現(xiàn)目的條帶(圖2)，表明重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2成功轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌中。

2.3 SDS-PAGE鑒定SLP-EpitopeS2的表達(dá)

SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現(xiàn)一條明顯的條帶，與目的蛋白預(yù)計(jì)大小相符，而副干酪乳桿菌陰性對(duì)照則在相應(yīng)位置處沒(méi)有出現(xiàn)條帶(圖3A)，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果可初步判定SLP-EpitopeS2融合基因在副干酪乳桿菌中得到了表達(dá)。

2.4 Western blotting 鑒定SLP-EpitopeS2的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌可與PEDV B細(xì)胞表位單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，在48 ku處出現(xiàn)一條高特異性的條帶，而副干酪乳桿菌陰性對(duì)照則未出現(xiàn)任何條帶(圖3B)。表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳桿菌中成功表達(dá)。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，重組副干酪乳桿菌PCR產(chǎn)物；3，副干酪乳桿菌PCR產(chǎn)物 M，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of recombinant Lactobacillus paracasei；3，PCR product of Lactobacillus paracasei圖2 重組副干酪乳桿菌鑒定Fig.2 Identification of recombinant Lactobacillus paracasei

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2，陰性對(duì)照；3，SLP-EpitopeS2蛋白表達(dá) M，Protein Marker；1 and 2，Negative control；3，SLP-EpitopeS2 protein expression圖3 SLP-EpitopeS2蛋白表達(dá)的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鑒定Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) identification of SLP-EpitopeS2 protein expression

2.5 IFA結(jié)果

IFA結(jié)果顯示，重組副干酪乳桿菌幾乎全部被激發(fā)出了綠色熒光信號(hào)，而副干酪乳桿菌對(duì)照則沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的綠色熒光信號(hào)(圖4)，根據(jù)結(jié)果判斷融合基因SLP-EpitopeS2可能表達(dá)于副干酪乳桿菌表面。

A,綠色熒光下重組副干酪乳桿菌；B,白光下重組副干酪乳桿菌；C,綠色熒光下對(duì)照菌；D,白光下對(duì)照菌 A,Recombinant Lactobacillus paracasei under green fluorescence；B,Recombinant Lactobacillus paracasei under white light；C,Negative control under green fluorescence；D,Negative control under white light圖4 重組副干酪乳桿菌IFA鑒定(400×)Fig.4 IFA identification of recombinant Lactobacillus paracasei (400×)

2.6 重組副干酪乳桿菌膜蛋白鑒定結(jié)果

重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)照經(jīng)過(guò)LiCl處理后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定，結(jié)果重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，結(jié)合IFA結(jié)果推測(cè)融合基因表達(dá)于副干酪乳桿菌菌體表面(圖5)。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，重組菌膜蛋白；2，對(duì)照菌膜蛋白；3，重組菌培養(yǎng)上清；4，對(duì)照菌培養(yǎng)上清 M，Protein Marker；1，Membrane protein of recombinant bacteria；2，Membrane protein of control bacteria；3，Culture supernatant of recombinant bacteria；4，Culture supernatant of control bacteria圖5 膜蛋白中重組SLP-EpitopeS2的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) detection results of recombinant protein SLP-EpitopeS2 in membrane protein

3 討 論

過(guò)去的幾十年，豬流行性腹瀉給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]，引起了公眾的高度重視。接種疫苗仍是預(yù)防和控制PEDV最有效的方法[14]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者在PEDV疫苗研究方面作了大量的研究工作，研制了不同種類的疫苗[15]，對(duì)控制流行性腹瀉起到了良好的預(yù)防作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的滅活疫苗及減毒活疫苗在不久的將來(lái)可能會(huì)被基因工程疫苗等新疫苗替代。滅活疫苗雖然安全無(wú)毒，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，但免疫周期短，保護(hù)效果不佳[16]，減毒疫苗如果減毒不完全還可能引起疾病感染[17]，然而，表位疫苗安全穩(wěn)定，其分子質(zhì)量較小，不會(huì)引起機(jī)體的免疫抑制及排斥反應(yīng)[18]。由于表位肽本身免疫原性不高,因此可選用嗜酸乳桿菌SLP進(jìn)行融合，增強(qiáng)其免疫原性。

乳酸菌是一類被公認(rèn)的、安全的、對(duì)動(dòng)物和人體有益的微生物，在自然界中廣泛存在[19]，且與腸道健康密切相關(guān)，能依賴自身在腸道中的定植特性定植于胃腸道中，通過(guò)自身的發(fā)酵功能分泌有機(jī)酸、抗菌素、維生素和具有生物活性的肽等物質(zhì)，乳酸菌向宿主釋放的物質(zhì)可抵抗有害菌的生長(zhǎng)繁殖，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)胃腸道中的菌群平衡[20]。其中副干酪乳桿菌作為正常的腸道菌群，適應(yīng)胃腸道中高鹽、高酸性的環(huán)境，可在胃腸道環(huán)境中生存增殖，抗原蛋白也隨著菌體的復(fù)制而得到復(fù)制，并不斷向宿主釋放抗原蛋白。若將其開(kāi)發(fā)成口服疫苗將是一個(gè)新的突破。Guo等[21]將PEDVS1基因克隆到乳球菌表達(dá)載體pNZ8149中構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ8149-S1，并將重組菌免疫BALB/c小鼠評(píng)價(jià)免疫原性，結(jié)果顯示，重組乳酸乳球菌可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。Li等[22]將PEDVS基因克隆到乳酸菌表達(dá)載體pVE5523中，免疫小鼠評(píng)價(jià)免疫原性，與Guo等[21]研究結(jié)果相似，可高水平地誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫。上述試驗(yàn)結(jié)果雖證明重組乳酸菌免疫小鼠能產(chǎn)生較高水平的體液免疫、黏膜免疫應(yīng)答，但存在由于插入片段大而導(dǎo)致對(duì)PEDV野外變異株的特異性差和抗原蛋白的表達(dá)量不高等瓶頸問(wèn)題。

本試驗(yàn)首先擴(kuò)增出融合基因SLP-EpitopeS2，并將其克隆到乳桿菌表達(dá)載體pTRK892中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。應(yīng)用食品級(jí)副干酪乳桿菌作為載體菌可避免抗原蛋白的純化等繁瑣流程，且選擇表位基因在某種程度上可克服病毒變異所帶來(lái)的中和病毒效率低等關(guān)鍵問(wèn)題。SDS-PAGE和Western blotting 結(jié)果顯示，在相應(yīng)位置處出現(xiàn)特異性目的條帶，與多克隆抗體相比，選用單克隆抗體進(jìn)行Western blotting鑒定可有效減少與其他雜蛋白的交叉反應(yīng)，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)與單克隆抗體抗的特異性結(jié)合，表明融合蛋白SLP-EpitopeS2還具備抗原性。在IFA中，成功解決了S2基因 B細(xì)胞表位肽在副干酪乳桿菌中能否有效表達(dá)的定性問(wèn)題，與副干酪乳桿菌對(duì)照相比，重組副干酪乳桿菌絕大多數(shù)菌體都能激發(fā)出綠色熒光信號(hào)。但遺憾的是由于實(shí)驗(yàn)室激光共聚焦顯微鏡的性能參數(shù)所限，未能更準(zhǔn)確地證實(shí)S2表位肽是否在乳酸菌膜上定位問(wèn)題。為補(bǔ)充證實(shí)該問(wèn)題，使用4 mol/L高濃度的LiCl處理重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)照，非特異性洗脫出乳桿菌表面上的膜蛋白，在這種高濃度的LiCl洗脫條件下，菌體表面混雜的膜蛋白幾乎都被洗脫下來(lái)，但對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷甚微[23]。所以結(jié)合單克隆抗體高特異性識(shí)別目的融合蛋白，推測(cè)融合蛋白SLP-EpitopeS2可能在副干酪乳桿菌菌體表面表達(dá)。表達(dá)量高且展示于載體菌膜表面的蛋白是開(kāi)發(fā)口服疫苗較高的優(yōu)勢(shì)[24]，但由于本試驗(yàn)尚未進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)而不能確定重組副干酪乳桿菌作為口服疫苗能否有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答。在今后還需通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)確定其免疫原性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)選擇乳酸菌表達(dá)載體pTRK892成功構(gòu)建了PEDV EpitopeS2 B細(xì)胞表位嵌入型SLP融合表達(dá)載體，并成功在副干酪乳桿菌中表達(dá)，為今后進(jìn)行PEDV 新型活菌載體疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。