H9N2亞型禽流感病毒NP蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體制備

楊 景，張新宇，梁志鵬，程 晴，王聰穎，池仕紅，袁 生，郭錦玥，黃淑堅(jiān)，溫 峰

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是近年來(lái)對(duì)家禽危害最大、傳播范圍最廣的一種低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)[1]。中國(guó)最早于1992年由陳伯倫等[2]在雞群分中離出H9N2亞型AIV，隨后該亞型AIV在中國(guó)各個(gè)省份廣泛傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的危害[3-4]。雖然H9N2亞型AIV在人上所引起的癥狀較輕[5-6]，也未曾在人群中有效傳播，但它可以為H7N9、H5N6等高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)提供內(nèi)部基因[7-9]，可見(jiàn)其對(duì)公共衛(wèi)生安全也造成了不容忽視的潛在危害。因此，對(duì)于H9N2亞型AIV疫情的監(jiān)測(cè)和防控工作至關(guān)重要。

本研究前期在華南地區(qū)分離到1株新型H9N2亞型AIV變異株，其基因組是由G1、Y280和F98系病毒三源重組產(chǎn)生的[10]。值得注意的是，幾乎所有人類(lèi)感染的H9N2亞型AIV均來(lái)自G1和Y280系[11-12]。流感病毒的核蛋白(nucleo protein,NP)在AIV感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。NP可以結(jié)合聚合酶蛋白復(fù)合體形成病毒核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein,vRNP)復(fù)合物進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[13]。NP蛋白在不同亞型AIV間的保守度超過(guò)90%[14]，且H9N2常為其他亞型AIV提供內(nèi)部基因(包括NP在內(nèi))[15]，NP蛋白的單克隆抗體常被應(yīng)用于AIV血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)[16-17],因此NP蛋白適合作為AIV通用檢測(cè)方法的靶蛋白。本研究針對(duì)近期分離到的新型H9N2亞型AIV的NP蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)及多克隆抗體制備，以期為建立AIV通用血清學(xué)檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD18T-BS/19-NP由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；原核表達(dá)載體pET-32a(+)、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21(DE3)和E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自南京諾唯贊科技股份有限公司；高保真PCR酶、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；BamH Ⅰ、SalⅠ及T4連接酶均購(gòu)自NEB公司；IPTG、His標(biāo)簽抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、考馬斯亮藍(lán)快速染色液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、弗式佐劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NP蛋白單克隆抗體購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF、ECL顯色液均購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司。80日齡健康雌性新西蘭大白兔購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(粵)2019―0035)。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院(許可證號(hào)：SYXK(粵)2020―0235)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)BS/19NP基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上、下游引物分別添加BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)。引物序列為：H9N2-NP-F：5′-CGCGGATCCATGGCGTCTCA-AGGCAC-3′；H9N2-NP-R：5′-CCGGTCGACTT-TCTTTAATTGTCATACTCC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 NP蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD18T-BS/19-NP為模板擴(kuò)增H9N2亞型AIV的NP基因。PCR反應(yīng)體系25 μL：高保真PCR酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，模板質(zhì)粒(0.1 ng/μL)1 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，將其克隆至pMD18-T載體，重組質(zhì)粒命名為pMD18T-H9N2-NP。將帶有酶切位點(diǎn)的pMD18T-H9N2-NP質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切。按照T4 DNA連接酶說(shuō)明書(shū)在16 ℃連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，命名為pET-32a-H9N2-NP，經(jīng)酶切鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4 NP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-32a-H9N2-NP同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取含pET-32a-H9N2-NP及pET-32a(+)空載體質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)菌液，按1∶100(V/V)分別接種至含Amp的LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)約3 h(至菌液D600 nm值為0.6)，取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG后，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4 h。4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.5 NP蛋白Western blotting鑒定

菌體蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉在搖床室溫封閉2 h后，用PBST沖洗3次；分別采用His標(biāo)簽抗體和NP蛋白抗體作為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，用PBST沖洗3次；以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)為二抗，在搖床室溫孵育2 h，用PBST沖洗3次；采用ECL顯色液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，鑒定目的蛋白。

1.6 表達(dá)條件的優(yōu)化及可溶性分析

為提高NP蛋白的表達(dá)量，對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8 h)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)作未誘導(dǎo)對(duì)照，并比較16、25與37 ℃時(shí)蛋白在破碎上清和沉淀中的表達(dá)差異。各條件下的樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行分析。

1.7 蛋白純化、復(fù)性及濃縮

在優(yōu)化的條件大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，收集菌體沉淀，超聲破碎后，將包涵體蛋白用8 mol/L尿素變性，在變性條件下采用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行蛋白純化；將純化后的蛋白裝入透析袋中，在6、4、2、0 mol/L尿素濃度下進(jìn)行復(fù)性；將蛋白包埋在PEG20000中濃縮至目標(biāo)體積，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 兔多克隆抗體的制備及評(píng)價(jià)

以1 mg/只的劑量將純化的重組NP蛋白經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。首免采用等體積弗氏完全佐劑乳化蛋白；首免14、28 d后采用弗式不完全佐劑乳化蛋白，進(jìn)行二免和三免；三免7 d后進(jìn)行心臟采血分離血清。分別以純化后的NP蛋白和H9N2亞型AIV病毒液作為抗原，以制備的兔多克隆抗體作為一抗，按1.4方法進(jìn)行Western blotting分析。將H9N2亞型AIV接種96孔板MDCK細(xì)胞，感染24 h后每孔加入100 μL的甲醇、丙酮混合液(1∶1)固定細(xì)胞。將自制兔抗NP血清用PBS從1∶100(V/V)開(kāi)始進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)鳛橐豢?，同時(shí)將免疫前的兔血清稀釋100倍作為陰性對(duì)照，進(jìn)行間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)試驗(yàn)。將純化的重組NP蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA測(cè)定所制備的NP蛋白多克隆抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 H9N2 NP基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

PCR擴(kuò)增H9N2NP基因使其帶上酶切位點(diǎn)，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小約1 500 bp(圖1A)，與預(yù)期大小相符。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，與pET-32a(+)同時(shí)酶切后構(gòu)建pET-32a-H9N2-NP重組質(zhì)粒，菌液PCR擴(kuò)增出約1 500 bp的片段，雙酶切后得到1 500和5 900 bp兩條帶，均分別與預(yù)期大小一致(圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆至pET-32a(+)載體的H9N2NP基因序列與原始毒株序列一致，表明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M1，DL5000 DNA Marker；1，H9N2 NP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2，陰性對(duì)照；3，重組質(zhì)粒pET-32a-H9N2-NP；4，重組質(zhì)粒pET-32a-H9N2-NP經(jīng)BamH Ⅰ單酶切鑒定；5，重組質(zhì)粒pET-32a-H9N2-NP經(jīng)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定；M2，DL10000 DNA Marker M1，DL5000 DNA Marker；1，PCR amplification products of of H9N2 NP gene;2，Negtive control;3，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP;4，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP identified by BamH Ⅰ digestion；5，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP identified by BamH Ⅰ and Sal Ⅰ digestion;M2，DL10000 DNA Marker圖1 H9N2 NP基因擴(kuò)增(A)及重組質(zhì)粒酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of H9N2 NP gene (A) and enzymatic digestion identification of the recombinant plasmids (B)

2.2 NP蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和Western blotting鑒定

將pET-32a-H9N2-NP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后菌樣進(jìn)行12% SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后顯示，誘導(dǎo)后的重組菌pET-32a-NP/Rosetta(DE3)在70 ku附近有一條十分明顯的條帶，與預(yù)期大小一致，而誘導(dǎo)后的重組菌pET-32a-NP/BL21(DE3)在相同位置也有一條很細(xì)的條帶，遠(yuǎn)低于在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的表達(dá)量(圖2A)。Western blotting結(jié)果表明，該蛋白能與His標(biāo)簽抗體和NP蛋白抗體結(jié)合(圖2B、2C)。對(duì)重組NP蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定在1 mmol/L IPTG、37 ℃條件下誘導(dǎo)7 h為最佳誘導(dǎo)條件，且目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(圖3～5)。

2.3 親和層析純化與鑒定

為確保His標(biāo)簽?zāi)軌驈氐妆┞?，將包涵體蛋白超聲破碎后在變性條件下溶解，然后采用鎳柱進(jìn)行親和層析純化，蛋白純化效果見(jiàn)圖6，純化后的蛋白較純化前雜蛋白明顯減少。

2.4 濃縮后蛋白濃度測(cè)定及Western blotting鑒定

純化后的蛋白在6、4、2、0 mol/L尿素下進(jìn)行復(fù)性，然后包埋在PEG20000中進(jìn)行濃縮，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得蛋白濃度為0.2 mg/mL。Western blotting結(jié)果表明，復(fù)性濃縮后的蛋白能與His標(biāo)簽抗體(圖7A)和NP蛋白抗體(圖7B)結(jié)合。

2.5 多克隆抗體驗(yàn)證及抗體效價(jià)測(cè)定

分別以純化后的NP蛋白和H9N2亞型AIV病毒液作為抗原，以制備的兔多克隆抗體作為一抗，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，所制備的兔多克隆抗體在稀釋104倍后仍能與NP蛋白和H9N2亞型AIV有效結(jié)合(圖8)。將H9N2亞型AIV接種96孔板MDCK細(xì)胞，感染24 h進(jìn)行IFA試驗(yàn)，以制備的兔多克隆抗體倍比稀釋后作為一抗，以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性血清在稀釋1 600倍后還能觀察到綠色熒光(圖9)。間接ELISA測(cè)得所制備的兔多克隆抗體效價(jià)高達(dá)1∶409 600(圖10)，表明NP蛋白具有良好的免疫原性。

① A，SDS-PAGE分析；B，Western blotting分析(一抗為His標(biāo)簽抗體)；C，Western blotting分析(一抗為NP抗體)。② M1，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pET-32a(+)/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)后；2，pET-32a(+)/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；3，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)前；4，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)后；5，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導(dǎo)前；6，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；M2，彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；7，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；8，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)前；9，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)后 ① A，SDS-PAGE analysis;B，Western blotting analysis (the primary antibody is His tag antibody);C，Western blotting analysis (the primary antibody is NP antibody).② M1，Protein Marker;1，pET-32a(+) after induction in E. coli Rosetta(DE3);2，pET-32a(+) after induction in E. coli BL21(DE3);3，pET-32a-NP without induction in E. coli Rosetta(DE3);4，pET-32a-NP after induction in E. coli Rosetta(DE3);5，pET-32a-NP without induction in E. coli BL21(DE3);6，pET-32a-NP after induction in E. coli BL21(DE3);M2，Prestained Protein Marker;7，pET-32a-NP after induction in E. coli BL21(DE3);8，pET-32a-NP without induction in E. coli Rosetta(DE3);9，pET-32a-NP after induction in E. coli Rosetta(DE3)圖2 pET-32a-NP/BL21(DE3)、pET-32a-NP/Rosetta(DE3)重組蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant pET-32a-NP protein in E. coli BL21(DE3)and Rosetta (DE3)

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L；9，空載體對(duì)照 M，Protein Marker;1-8，Concentrations of IPTG were 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 and 1.6 mmol/L,respectively;9，Blank vector control圖3 不同濃度IPTG誘導(dǎo)NP蛋白表達(dá)Fig.3 NP protein expression induced by different concentrations of IPTG

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8 h M，Protein Marker;1-9，Induction time was 0，1，2，3，4，5，6，7 and 8 h,respectively圖4 不同時(shí)間誘導(dǎo)NP蛋白表達(dá)Fig.4 NP protein expression induced by different time

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)后全菌；2，未誘導(dǎo)全菌；3，16 ℃誘導(dǎo)上清；4，16 ℃誘導(dǎo)沉淀；5，25 ℃誘導(dǎo)上清；6，25 ℃誘導(dǎo)沉淀；7，37 ℃誘導(dǎo)上清；8，37 ℃誘導(dǎo)沉淀 M，Protein Marker;1，F(xiàn)ull bacteria after induction;2，F(xiàn)ull bacteria without induction;3，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 16 ℃;4，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 16 ℃;5，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 25 ℃;6，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 25 ℃;7，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 37 ℃;8，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 37 ℃圖5 不同溫度誘導(dǎo)NP蛋白表達(dá)Fig.5 NP protein expression induced by different temperatures

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1，純化后的重組蛋白;2，未純化重組蛋白 M，Prestained Protein Marker;1，Purified recombinant protein;2，Unpurified recombinant protein圖6 NP蛋白純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE result of the purification of NP protein

①A，一抗為His標(biāo)簽抗體；B，一抗為NP蛋白抗體。②M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，純化后的重組蛋白；2，未純化的重組蛋白 ①A，The primary antibody is His tag antibody;B，The primary antibody is NP protein antibody. ②M，Prestained Protein Marker;1，Purified recombinant protein;2，Unpurified recombinant protein圖7 純化后重組蛋白的Western blotting鑒定Fig.7 Western blotting identification of the purified recombinant protein

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，抗原為純化后的重組蛋白；2，抗原為H9N2亞型AIV M，Prestained Protein Marker;1，The antigen is purified recombinant protein;2，The antigen is H9N2 subtype AIV圖8 NP抗血清Western blotting鑒定Fig.8 Western blotting identification of NP antiserum

圖9 NP抗血清IFA驗(yàn)證(100×)Fig.9 IFA result of NP antiserum (100×)

圖10 NP抗血清抗體效價(jià)測(cè)定Fig.10 Antibody titer determination of NP antiserum

3 討 論

H9N2亞型AIV在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[18]，但其引起的臨床癥狀不夠典型，與一些其他病毒引起的癥狀相似[19]。H9N2能造成家禽的免疫抑制，導(dǎo)致其他呼吸道疾病的嚴(yán)重繼發(fā)感染[19-20]，臨床病理表現(xiàn)復(fù)雜，因此需要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)進(jìn)行確診。HI試驗(yàn)是AIV常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，但HI試驗(yàn)針對(duì)的靶蛋白是HA。HA蛋白時(shí)常為了逃避免疫而發(fā)生抗原漂移，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)抗體血清與流行株的交叉反應(yīng)能力下降[21]，造成HI試驗(yàn)的靈敏度下降。而NP蛋白具有型特異性，在不同亞型AIV間的保守度超過(guò)90%，因此常被選作為流感病毒ELISA檢測(cè)的靶蛋白。Wu等[22]建立了H9N2亞型AIV NP蛋白的ELISA檢測(cè)方法，該方法較HI試驗(yàn)更加靈敏，且能夠同時(shí)檢測(cè)H1～H15亞型甲型流感病毒。因此，以NP蛋白為靶點(diǎn)的AIV檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)前期分離到的1株三源重組的Y280系H9N2亞型AIV進(jìn)行了NP蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體制備，旨在為后期單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

本研究中，H9N2 NP蛋白在大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，與樓晶瑤[23]研究結(jié)果一致。大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞較大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞補(bǔ)充了6種稀有密碼子，序列分析發(fā)現(xiàn)，BS/19 NP蛋白中大腸桿菌稀有密碼子約占20%，因此更易在大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，目的蛋白以包涵體沉淀的形式表達(dá)。包涵體的產(chǎn)生是由于蛋白在大腸桿菌中表達(dá)過(guò)快而來(lái)不及正確折疊[24-25]，后期需要經(jīng)過(guò)繁瑣的變性、復(fù)性來(lái)純化并得到具有正確生物學(xué)活性的蛋白。通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度能夠使目的蛋白緩慢表達(dá)以增加蛋白折疊的時(shí)間，本研究在25 ℃誘導(dǎo)時(shí)，破碎上清中也能檢測(cè)到目的蛋白，但大部分仍以包涵體沉淀的形式表達(dá)，且破碎上清中雜蛋白較多，不利于下游的純化工作，今后可以嘗試通過(guò)在載體上引入可溶性標(biāo)簽來(lái)幫助目的蛋白的可溶性表達(dá)。

通過(guò)ELISA測(cè)得所制備的兔抗NP血清效價(jià)達(dá)到1∶409 600，表明NP蛋白具有良好的免疫原性。但本研究的免疫原為帶有His標(biāo)簽的重組NP蛋白，同時(shí)ELISA試驗(yàn)的包被抗原也帶有His標(biāo)簽。雖然His標(biāo)簽的分子質(zhì)量很小，但抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果也可能會(huì)受到影響。Western blotting及IFA試驗(yàn)結(jié)果均表明，所制備的NP抗血清能夠高效地與H9N2亞型AIV結(jié)合，且特異性良好，可作為后期AIV NP蛋白血清學(xué)鑒定的生物材料。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了H9N2亞型AIV NP蛋白，通過(guò)鎳柱親和層析獲得了純度較高的重組蛋白。免疫新西蘭大白兔后獲得NP蛋白多克隆抗體，間接ELISA測(cè)得抗體效價(jià)為1∶409 600，NP多克隆抗體能與BS/19病毒高效結(jié)合，表明NP蛋白免疫原性良好，可作為后期試驗(yàn)的生物材料。