新風膠囊通過調控巨噬細胞極化改善活動期類風濕關節(jié)炎患者炎癥反應及生活質量的研究?

曹云祥， 劉 健△， 陶艷紅， 黃傳兵， 黃 旦， 徐昌萍

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學， 合肥 230031)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是多因素導致可累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，主要表現為對稱性、侵蝕性多關節(jié)炎[1]，女性發(fā)病率較高，約為男性的3倍，多發(fā)生于30～50歲的中青年，全球患病率約1%，中國為0.32% ～0.36%[2，3]。隨著疾病的發(fā)展，RA患者最終可出現關節(jié)功能障礙，對生活質量產生較大的影響。除關節(jié)表現外，該病還可累及神經、消化、血液、內分泌等多個系統(tǒng)，大多數患者的死亡原因為關節(jié)外病變[4，5]。目前RA的發(fā)病機制仍不明確，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1等促炎因子被認為參與RA的發(fā)生發(fā)展。目前，慢作用抗風濕藥、生物制劑等一線治療藥物的臨床使用極大地提高了RA治療的成功率[6]，但治療后會發(fā)生不同程度的不良反應，中醫(yī)藥治療本病有較好的互補效應。

RA屬于中醫(yī)學“痹證” “尪痹”范疇，中醫(yī)藥辨證論治聯合西藥治療RA不僅能增加療效，減少致殘率，提高生活質量，還能減少西藥用量，減輕西藥的毒副作用。本研究旨在通過觀察中藥復方新風膠囊(xinfeng capsule，XFC)對RA患者巨噬細胞極化及核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影響，探究其作用機制。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批號20190627)。

1 資料

1.1 一般資料

選擇2020年5月至2020年10月安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕病科門診與病房就診病例60例RA患者，按照隨機數字表法分為對照組和研究組。其中，治療組男性6例，女性24例，平均年齡(55. 57±6.89)歲，平均病程(8.26±3.65) 年。對照組男性4例，女性26例，平均年齡(51.73±8.76)歲，平均病程(8.31±3.49) 年。2組患者年齡與病程比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 診斷標準

西醫(yī)診斷標準參照2010 年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯盟提出的《最新RA分類標準和評分系統(tǒng)》，總分6分以上可診斷RA[7]。中醫(yī)診斷標準參照2019年中華中醫(yī)藥學會發(fā)布的《RA病證結合診療指南》[8]。

1.3 納入標準

符合RA分類診斷標準；年齡20～70歲；知情同意并配合藥物治療的患者。

1.4 排除標準

不符合納入標準；合并其他系統(tǒng)如腫瘤、感染等疾病者；關節(jié)畸形嚴重者。

1.5 脫落標準

依從性差，服用藥物劑量少于規(guī)定量的80%或超出120%，療效及安全性判斷受干擾者；自行退出者；病情加重或者有其他疾病需要治療者；發(fā)生嚴重副作用者。

1.6 剔除標準

不遵守規(guī)定服藥，隨訪資料欠缺者；不遵守治療方案而影響療效或安全性者；曾經有或者現仍濫用藥物者。

1.7 主要試劑及儀器

TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10 Elisa試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，貨號JYM0110Hu、JYM0083Hu、JYM0142Hu、JYM0155Hu)；淋巴細胞分離液(加拿大StemCell公司，貨號17952)；熒光定量 PCR檢測試劑盒(蘇州近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B)；RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0013B)；核因子κB P65(nuclear factor kappa-B P65, NF-κB p65)抗體、核轉錄因子κB抑制蛋白α(nuclear transcription factor kappa B repressor protein alpha, IκBα)抗體(美國CST公司，貨號8242 T、3033 T)；β-actin抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號TA-09、ZB-2305、ZB-2301)。

2 方法

2.1 治療方法

對照組患者給予甲氨蝶呤口服每周1次，每次4片；治療組在對照組基礎上加XFC口服治療，每日3次，每次 3 粒。甲氨蝶呤由上海上藥信誼藥廠有限公司提供(國藥準字H21020644，2.5 mg)。XFC組成：黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤，每粒含生藥0.4 g，由安徽省中醫(yī)院制劑中心生產(批號皖藥制 Z20050062)，2 組患者均連續(xù)服藥4周。

2.2 生活質量評價

RA患者生活質量采用中醫(yī)證候積分量表與生活質量評價量表(short form-36, SF-36)進行評價[9，10]。由受過培訓的醫(yī)務人員對研究對象進行量表填寫指導，所有量表在發(fā)放后1 h收回，確保全部回收并檢查有無漏填之處。SF-36評分量表具體條目包括一般健康(general health, GH)、生理功能(physical functioning, PF)、生理職能(role-physical, RP)、情感職能(role-remotional, RE)、社會功能(social functioning, SF)、軀體疼痛(body pain, BP)、精力(vitality, VT)、精神健康(mental health, MH)。

2.3 Elisa檢測血清炎癥因子表達

取各組患者治療前后空腹靜脈血離心取上清，參考試劑盒操作說明書檢測各組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表達。

2.4 RA相關指標RF、CCP-AB、ESR、CRP檢測

取各組患者治療前后空腹靜脈血，Elisa法檢測血清類風濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide, CCP-AB)；魏氏法檢測血漿紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),免疫透射比濁法檢測血清C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)，以上指標均由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗中心檢測。

2.5 流式細胞術檢測巨噬細胞標志物CD80、CD86、CD163、CD206表達

取各組患者治療前后空腹靜脈血，免疫磁珠法分選巨噬細胞，配制含10%人AB血清和10ng/mL人GM-CSF的IMDM培養(yǎng)液，培養(yǎng)基重懸CD14細胞，誘導分化成巨噬細胞。調整巨噬細胞濃度為0.5×106/L～1×106/L個細胞，處理后上機檢測。

2.6 Western blot檢測巨噬細胞中NF-κB p65、IκBα蛋白表達

加入RIPA細胞裂解液，提取治療前后各組巨噬細胞中總蛋白，加樣、電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h洗滌，加一抗IκBα(1∶500)、NF-κB p65(1∶1000)4 ℃過夜，加1∶10000二抗孵育2 h，顯影后拍照、保存圖像并分析數據。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 脫落情況

無患者脫落，全部完成研究。

3.2 新風膠囊對RA患者生活質量的影響

表1示，與治療前比較，2組患者治療后中醫(yī)證候積分均明顯降低(P<0.01)，SF-36各條目評分均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，治療組患者SF-36量表RE、SF、BP、VT條目評分明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組類風濕關節(jié)炎患者中醫(yī)證候積分與SF-36評分比較(分，

3.3 新風膠囊對RA患者血清炎癥因子的影響

表2示，與治療前比較，2組患者治療后TNF-α、IL-1β表達水平均明顯降低，IL-4、IL-10表達水平均明顯升高(P<0.01)；與對照組治療后比較，治療組治療后TNF-α表達水平明顯降低，IL-10表達水平明顯升高(P<0.05)。

表2 各組類風濕關節(jié)炎患者血清炎癥因子表達比較

3.4 新風膠囊對RA患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP的影響

表3示，與治療前比較，2組患者治療后RF、CCP-AB、ESR、CRP表達水平均明顯降低(P<0.01)；與對照組治療后比較，治療組治療后RF、ESR、CRP表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組類風濕關節(jié)炎患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP水平比較

3.5 新風膠囊對RA患者巨噬細胞極化標志物的影響

圖1示，2組患者治療前巨噬細胞極化標志物表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。流式細胞術檢測結果顯示，2組患者治療后與各自治療前比較，巨噬細胞CD80、CD86 表達明顯降低，CD163、CD206表達明顯升高(P<0.05)；治療組治療后較對照組CD80、CD86 表達顯著降低，CD163、CD206 表達明顯升高(P<0.05)。

注：A.各組流式圖； B.細胞標記率；與本組治療前比較：*P<0.05；與對照組治療后比較：#P<0.05；FL1-A—PE/cy7anti-humancd80，FL2-A—APC anti-humancd86，FL3-A—FITC anti-humancd206，FL4-A—PE anti-humancd163圖1 各組類風濕關節(jié)炎患者治療前后巨噬細胞極化標志物表達比較

3.6 新風膠囊對RA患者NF-κB p65、IκBα蛋白表達的影響

圖2示，與治療前比較，2組患者治療后NF-κB p65蛋白表達明顯降低，IκBα明顯升高(P<0.05)；與對照組治療后比較，治療組患者NF-κB p65蛋白表達明顯降低，IκBα明顯升高(P<0.05)。

注：A.蛋白條帶圖；B.蛋白相對表達量；與本組治療前比較：*P<0.05；與對照組治療后比較：#P<0.05圖2 各組類風濕關節(jié)炎患者NF-κB p65、IκBα 蛋白表達比較

3.7 不良反應

治療過程中，觀察組出現1例胃脘部不適患者，對照組出現 1 例白細胞降低患者，處理后均恢復正常。

4 討論

RA是一種慢性、進展性和難治性的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎、血管翳形成、軟骨和骨的破壞為特征，最終可導致關節(jié)畸形[11]。RA患者關節(jié)持續(xù)疼痛、免疫炎癥反應和關節(jié)功能障礙癥狀嚴重影響生活質量。甲氨蝶呤為治療RA的一線藥物，然而部分患者因多種原因不能耐受，因此尋求適合RA患者的中西醫(yī)結合治療方案有較大的臨床意義。

劉健[12]認為，脾胃虧虛、氣血不足、痰瘀痹阻為RA基本病機，治療應以健脾化濕通絡為法。XFC又稱復方芪薏膠囊，為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑(專利號ZL201310011369.8)，全方由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成，應用于臨床30年療效顯著。前期進行的一項大樣本、多中心平行組設計、雙盲的隨機對照試驗結果顯示，XFC能夠有效改善RA患者關節(jié)癥狀，緩解病情，總體療效優(yōu)于來氟米特[9]。XFC具有很好的抗炎、抑制免疫炎癥反應的作用，能降低RA患者ESR、hs-CRP、RF、CCP等實驗室指標，還能通過抑制NF-κB通路激活，降低血清中促炎因子的水平來減輕免疫炎癥反應，改善RA癥狀[13，14]。

多種免疫細胞與炎性介質在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用[15]。單核巨噬細胞作為機體防御系統(tǒng)重要的免疫細胞，在免疫調節(jié)和炎癥反應過程中具有多方面的作用。不同因素可誘導不同亞型的巨噬細胞，表現為具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型[16-18]。巨噬細胞大量向M1極化，炎癥因子分泌失衡，誘發(fā)“細胞因子風暴”。大量的促炎因子聚集會抑制組織的修復和血管重塑，并促進免疫反應；同時M2細胞減少，抗炎因子表達下降，進一步加劇免疫炎癥反應。巨噬細胞大量遷移到靶器官、組織并被激活，引起滑膜炎癥及晨僵，最終導致炎性骨破壞。M1型巨噬細胞可分泌多種促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1等)，表達CD80、CD86等分子，促進炎癥的發(fā)展。M2型巨噬細胞分泌抗炎因子(IL-4、IL-10、TGF-β等)，表達CD206和CD163等分子，發(fā)揮抗炎作用。因此，抑制巨噬細胞M1型炎性極化，驅動M1型轉為M2型，促進恢復M1/M2型巨噬細胞動態(tài)平衡，有利于調節(jié)RA免疫炎癥反應。本研究表明，XFC可能是通過降低RA患者CD80、CD86、TNF-α、IL-1β、ESR、CRP表達，升高CD163、CD206、IL-4、IL-10表達，調整M1/M2型巨噬細胞極化失衡，從而降低中醫(yī)證候積分，改善生活質量。

NF-κB通路是重要的促炎傳導途徑，被認為是巨噬細胞極化的重要調控因子，該通路激活能促進M1/M2極化，使細胞因子表達失衡，引發(fā)炎癥反應[19，20]。IκBα是NF-κB信號通路的重要成員，主要抑制NF-κB的激活及轉錄，調節(jié)免疫炎癥反應[21]。本研究表明，XFC能顯著降低NF-κB p65、升高IκBα蛋白表達，通過調控IκBα抑制NF-κB信號通路激活，繼而平衡M1/M2極化，減輕RA的炎癥反應，發(fā)揮治療RA的作用。

綜上，本研究初步表明，XFC能夠通過抑制NF-κB通路過度活化，調控M1/M2極化，上調抗炎因子,下調促炎因子表達，改善 RA患者的生活質量。