保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠Cx-43基因表達(dá)及宮頸成熟相關(guān)指標(biāo)的影響

亢雪峰,馬 蘭,鐘偉蘭,戴衛(wèi)波,林 慧,黃淑媛

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東 中山 528400;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室，廣東 中山 528400)

宮頸成熟度是引產(chǎn)成功的關(guān)鍵，也是分娩發(fā)動(dòng)的一個(gè)必要條件[1]。如果處理欠妥，將會(huì)使難產(chǎn)率大大增加，有可能危及母嬰生命。保產(chǎn)無憂散首見于《傅青主女科》，且多本醫(yī)書均有記載，有“未產(chǎn)能安，臨產(chǎn)能催”的神效[2]。以往報(bào)道顯示[3]，保產(chǎn)無憂散可以促妊娠足月孕婦宮頸成熟，減少宮縮乏力的發(fā)生，縮短第一產(chǎn)程，并可降低剖宮產(chǎn)率。但其具體作用機(jī)制尚未明確，已有臨床研究顯示，縫隙連接蛋白43(Connexin-43，Cx-43)的表達(dá)升高可增強(qiáng)妊娠晚期子宮肌層縫隙連接功能，進(jìn)而促使子宮前列腺素 E2(Prostaglandin，PEG2)、宮頸白介素-8(Interleukin-8，IL-8)以及宮頸基質(zhì)金屬蛋白酶 9(Matrix meytallopeptidase-9，MMP-9)的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)宮頸成熟作用[4-5]。本研究結(jié)合前期研究，采用“保產(chǎn)無憂散”處方干預(yù)的方法，通過對孕晚期大鼠子宮 Cx-43 基因及蛋白表達(dá)的測定及對宮頸成熟相關(guān)指標(biāo)PEG2、IL-8及MMP-9的表達(dá)測定，以探討保產(chǎn)無憂散促進(jìn)宮頸成熟的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇SPF級雌性SD大鼠，體重300～350 g。購買時(shí)除空白對照組(未孕鼠)外，其余雌鼠均為受孕第10天。大鼠由珠海百試驗(yàn)通生物科技有限公司提供，許可證號SYXK(粵)2020-0109。

1.1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組：孕鼠每籠1只單獨(dú)喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，屏障級環(huán)境，12 h光照和黑夜循環(huán)，隔日換墊料，專室飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)。標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，實(shí)驗(yàn)時(shí)將妊娠SD大鼠隨機(jī)分為三組，分別為模型對照組、保產(chǎn)無憂散低劑量給藥組(低劑量給藥組)與保產(chǎn)無憂散高劑量給藥組(高劑量給藥組)。

1.1.3 藥物：保產(chǎn)無憂散組方為當(dāng)歸、荊芥炭、川芎、艾葉、枳殼、炙黃芪、莬絲子、厚樸、羌活、川貝母、白芍、生姜、甘草各5 g。

1.1.4 主要儀器：Multiskan FC型全波長酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher公司)；2-16R高速冷凍離心機(jī)(湖南恒諾設(shè)備儀器有限公司)；F6/10超細(xì)勻漿器(德國FLUKO公司)。

1.1.5 主要試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)，由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；大鼠Cx-43 ELISA試劑盒，由天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司提供，批號：225-P01。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物煎煮：稱取以上13味藥物，加水共煎煮2次。第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，合并兩次煎液，濾過。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比，將人日用藥量換算成大鼠的劑量，將藥液濃縮為含生藥1.17 g/ml，即相當(dāng)于人臨床常用量的2倍劑量，作為高劑量組給藥量；倍比稀釋成含生藥0.585 g/ml，相當(dāng)于人臨床常用量的1倍劑量，作為低劑量組給藥量。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組：取受孕成功的孕鼠30只，采用隨機(jī)法將孕鼠分成模型對照組、低劑量給藥組、高劑量給藥組三組，每組各10只。另取11只未孕鼠作為正常對照組。

1.2.3 動(dòng)物給藥方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，保產(chǎn)無憂散低、高劑量給藥組孕鼠于妊娠第16天開始給藥，1次/d，均按1 ml/100 g體重灌胃給藥。模型對照組(孕鼠)、空白對照組(未孕鼠)均予以蒸餾水灌胃，所有動(dòng)物連續(xù)灌胃5 d，每天觀察及稱體重1次。于孕鼠妊娠第20天，給藥后2 h，采用頸椎脫臼處死大鼠，冰上解剖取子宮，在冰上分離宮體及宮頸，剔除宮頸外圍疏松組織及剝離胎兒及胎兒附屬組織，將子宮分為子宮體、子宮頸兩部分。

1.2.4 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)

1.2.4.1 子宮組織處理方法：取子宮組織50～500 mg，置于玻璃勻漿試管中，加入預(yù)冷的0.86%氯化鈉水溶液(450～4500 ml)，一手握住勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，一手持搗桿垂直插入套管中，充分研碎子宮組織，使其勻漿化，最后將制備好的10%勻漿(4000 r/min)離心15 min，取上清液備用。

1.2.4.2 子宮體Cx-43含量測定：取一部分子宮體經(jīng)液氮降溫后放置在-20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定Cx-43的表達(dá)，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測各組大鼠子宮體Cx-43含量。

1.2.4.3 子宮體Cx-43免疫組化檢測：取一部分子宮體用福爾馬林液固定，標(biāo)本制成石蠟塊，免疫組化檢測Cx-43的表達(dá)，由武漢賽維爾生物科技有限公司提供技術(shù)支持。應(yīng)用組織切片數(shù)字掃描系統(tǒng)采集免疫組化切片上的圖像，利用賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)讀取組織測量區(qū)域，先進(jìn)行陽性等級劃分。0分：陰性無著色；1分：弱陽性淡黃色；2分：中陽性棕黃色；3分：強(qiáng)陽性棕褐色。采用Histochemistry score(H-score，免疫組織化學(xué)評分)評分法[6]，將每張切片內(nèi)陽性數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，取其均值，間接反映其表達(dá)強(qiáng)度。H-score數(shù)值0～300，數(shù)值越大表示Cx-43綜合陽性越強(qiáng)。

1.2.4.4 大鼠子宮組織PEG2、IL-8、MMP-9水平：采用ELISA測定子宮前列腺素 E2(PEG2)、宮頸白介素-8(IL-8)以及宮頸基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1 (TIMP-1)水平，測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作程序操作。試劑盒均購于廈門慧嘉生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，免疫組化標(biāo)本采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 進(jìn)行圖像灰度值的半定量分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮體Cx-43含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量組及高劑量給藥組子宮Cx-43表達(dá)均顯著升高(t=-8.593,-12.374,-8.627，均P<0.001)，與模型對照組比較，低劑量給藥組Cx-43表達(dá)升高(t=-2.883,P=0.005)，高劑量給藥組表達(dá)下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.147，P=0.133)，見表1。

表1 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮體Cx-43含量的影響(ng/ml)

2.2 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度的影響 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量給藥組及高劑量給藥組子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度均顯著升高(t=-3.256,-5.572,-3.642，P=0.002,<0.001,<0.001)，與模型對照組比較，低劑量給藥組Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度升高(t=-1.950，P=0.033)，高劑量給藥組表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.653，P=0.261)，見表2(圖1)。

表2 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)的影響(分)

圖1 Cx-43免疫組化染色結(jié)果(HE染色，×200)

2.3 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮組織PEG2、IL-8、MMP-9及TIMP-1水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量給藥組、高劑量給藥組子宮組織中PEG2、IL-8、MMP-9、TIMP-1水平均顯著升高(PEG2：t=-3.423,-6.004,-5.079，P=0.001,<0.001,<0.001； IL-8：t=-6.097,-7.995,-5.430，均P<0.0011;MMP-9：t=-3.619,-6.172,-4.529，均P<0.001;TIMP-1:t=-2.522,-10.938,-10.938，P=0.011,<0.001,<0.001)，與模型對照組比較，低劑量給藥組子宮組織中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高(t=-2.157,-3.163,-2.671,-6.912，P=0.022,0.003,0.008,<0.001)，高劑量給藥組子宮組織中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.304,-0.567,-1.189,-1.610，P=0.104,0.289,0.125,0.062)，見表3。

表3 保產(chǎn)無憂散對孕晚期大鼠子宮組織PEG2、IL-8、MMP-9及TIMP-1水平的影響

3 討 論

各種原因引起胎兒生長受限、羊水過少、過期妊娠等仍是嚴(yán)重威害產(chǎn)婦及新生兒安全的關(guān)鍵因素，針對上述情況需要進(jìn)行主動(dòng)促分娩措施，不然則會(huì)增加圍生兒及產(chǎn)婦病死率[7-9]。引產(chǎn)是臨床主要的促分娩措施，宮頸成熟度是引產(chǎn)成功的重中之重，也是分娩發(fā)動(dòng)的前提條件[10-12]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為補(bǔ)氣養(yǎng)血、引胎下行是催生下胎之大法[13-15]。基礎(chǔ)研究顯示，補(bǔ)氣養(yǎng)血類中藥具有軟化子宮管、促進(jìn)宮頸膠原蛋白疏松和降解的作用，同時(shí)提高子宮平滑肌的興奮性。鄭丹如等[16]報(bào)道顯示，改善孕婦氣血兩虛證有利于促進(jìn)足月孕婦宮頸成熟。保產(chǎn)無憂散見于《傅青主女科》，有“未產(chǎn)能安，臨產(chǎn)能催”的神效，普遍流傳于民間，以防治難產(chǎn)。方中川芎、當(dāng)歸、芍藥可活血化瘀，厚樸、枳殼、羌活可行氣，荊芥、艾葉可溫行氣血，黃芪可益氣，菟絲子可護(hù)胎，全方共奏活血化瘀，益氣護(hù)胎之效，使血?dú)饬鲿?，機(jī)體充沛，有利于促進(jìn)分娩，降低難產(chǎn)發(fā)生率。前期臨床研究顯示[3]，保產(chǎn)無憂散能有效地促宮頸成熟，縮短第一產(chǎn)程，降低剖宮產(chǎn)率。

子宮收縮是分娩發(fā)動(dòng)及胎兒順利娩出的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而子宮收縮的前提是各種蛋白、分子等共同作用的結(jié)果，其中Cx-43蛋白在子宮收縮中起到關(guān)鍵性作用[2]。分娩啟動(dòng)子宮平滑肌收縮時(shí)，Cx-43快速上升，并在其動(dòng)作電位的產(chǎn)生中提供了低電阻位點(diǎn)，使電沖動(dòng)傳至整個(gè)子宮肌層誘發(fā)分娩，同時(shí)促使分娩時(shí)子宮肌同步收縮[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組子宮體Cx-43的含量、子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度與正常對照組比較顯著提高，低劑量給藥組子宮體Cx-43的含量、子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度與模型對照組比較顯著升高，但高劑量給藥組子宮體Cx-43的含量、子宮平滑肌中Cx-43陽性表達(dá)強(qiáng)度與模型對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低劑量保產(chǎn)無憂散可通過刺激Cx-43表達(dá)發(fā)揮促宮頸成熟的作用。

研究發(fā)現(xiàn)[18]，PEG2可以促進(jìn)子宮平滑肌收縮，增強(qiáng)子宮平滑肌收縮效應(yīng)，尤其是在分娩進(jìn)程中可以刺激催產(chǎn)素誘發(fā)的宮縮效果，進(jìn)而促進(jìn)分娩。IL-8是與妊娠存在緊密聯(lián)系的趨化因子之一[19]。妊娠末期趨化因子刺激宮頸組織中白細(xì)胞表達(dá)上升，基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)受到趨化因子的刺激釋放增加，MMP-9是MMPs的主要成員，底物為膠原纖維，是宮頸結(jié)締組織中的重要成分，在MMP-9表達(dá)增加的前提下可導(dǎo)致膠原纖維破壞，致使宮頸支持結(jié)構(gòu)遭到破壞，誘發(fā)子宮頸變軟、舒張，促進(jìn)宮頸成熟[20]。而TIMP-1對MMP-9有調(diào)控作用，二者保持動(dòng)態(tài)平衡以保證正常的宮頸成熟和擴(kuò)張。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組PEG2、MMP-9和IL-8的含量與正常對照組比較明顯升高，低劑量給藥組PEG2、MMP-9和IL-8的含量與模型對照組比較顯著升高，高劑量給藥組子宮組織中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低劑量保產(chǎn)無憂散可促進(jìn)妊娠晚期大鼠子宮收縮，促進(jìn)大鼠分娩，可能是通過促進(jìn)PEG2、MMP-9和IL-8合成和分泌而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，低劑量保產(chǎn)無憂散通過提高孕晚期大鼠子宮組織中Cx-43的表達(dá)及PEG2、MMP-9和IL-8含量，促進(jìn)宮頸成熟。本研究從分子生物學(xué)的角度明確了保產(chǎn)無憂散促進(jìn)大鼠宮頸成熟的作用機(jī)制，為臨床上保產(chǎn)無憂散輔助自然分娩的應(yīng)用提供了科學(xué)參考，但本研究未發(fā)現(xiàn)保產(chǎn)無憂散呈劑量依賴性。