高效液相色譜法同時(shí)測定山茶油中 9種抗氧化劑

山茶油作為東方橄欖油，含有豐富的不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分，其在儲(chǔ)存過程中易被氧化變質(zhì)和酸敗，導(dǎo)致其品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值降低，甚至引起食物中毒[1-2]。在山茶油中加入抗氧化劑可防止油脂氧化，提高山茶油的穩(wěn)定性，延長山茶油的保質(zhì)期[3]。山茶油中常加入的抗氧化劑主要有叔丁基對苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）、叔丁基對羥基茴香醚（Butyl Hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基對甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）和沒食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）等人工合成的酚類抗氧化劑，具有一定的毒性，我國對其在油脂的使用量有明確的限量要求[4-5]。隨著食品工業(yè)科技的發(fā)展，2,4,5-三羥基苯丁酮（2,4,5-trihydroxybutyrophenone，THBP）、去甲二氫愈創(chuàng)木酸（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA）、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（Ionox-100）、沒食子酸辛酯（Octyl Gallate，OG）和沒食子酸十二酯（Dodecyl Gallate，DG）等以抗氧化為目的的添加劑被越來越多地應(yīng)用于植物油中[6-7]。

抗氧化劑常用的檢測方法有液相色譜法[8-9]、氣相色譜法[10]和液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等，其中氣相色譜法受化合物極性、沸點(diǎn)限制，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法儀器設(shè)備昂貴、普及率低，且油樣的基質(zhì)效應(yīng)較大，不容易定量，限制了該方法的應(yīng)用。而液相色譜法在抗氧化劑上具有較高的靈敏度，且適用于NDGA、OG、DG等9種抗氧化劑的同時(shí)檢測。本文通過結(jié)合采用凝膠色譜和液相色譜，建立一種簡單快速、操作簡便，能夠同時(shí)測定山茶油中9種抗氧化劑含量的方法，為其他油脂樣品的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

42批次山茶油，市購。

TBHQ、BHA、BHT、PG、THBP、NDGA、Ionox-100、OG和DG等9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度均為1 000 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢；乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲醇、甲酸均為色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GPC Cleanup 800凝膠色譜儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；E2695型高效液相色譜儀，美國沃特世公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ML104型電子天平，梅特勒-托利多（上海）儀器公司；Milli-Q型純水機(jī)，美國Millipore公司；KQ-700DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取9種混合抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度，得100 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃保存，備用。臨用前用乙腈溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.50 mg·L-1、5.00 mg·L-1、10.0 mg·L-1和 50.0 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取5.00 g（精確至0.01 g）山茶油樣于50 mL容量瓶中，加入40 mL乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1，V∶V）溶液，超聲10 min，冷卻至室溫后定容至刻度，過0.45 μm有機(jī)濾膜。取5 mL樣液于GPC凈化系統(tǒng)，GPC流動(dòng)相：乙酸乙酯/環(huán)己烷（1∶1，V∶V），流速為5.0 mL·min-1，檢測波長為256 nm，樣品收集時(shí)間為7.50～16.0 min。將收集液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用初始流動(dòng)相定容至2.00 mL，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Stable Bond AQ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1.00 mL·min-1；檢測波長：280 nm；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.5%甲酸水溶液；洗脫程序：0～5.00 min，A55%；5.00～15.00 min，A 55%→35%；15.00～22.00 min，A 35%→20%；22.00～25.00 min，A20% → 10%；25.00～ 27.00 min，A 10% → 55%；27.00～35.00 min，A 55%。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPC凈化條件優(yōu)化

山茶油主要成分為脂肪酸，含有部分色素、礦物質(zhì)，凝膠色譜在凈化油類樣品時(shí)具有明顯的優(yōu)勢[12-13]，為確定9種抗氧化劑在凝膠色譜凈化系統(tǒng)的出峰時(shí)間，在1.3.2項(xiàng)下，以陰性樣品和加標(biāo)樣品上GPC系統(tǒng)，其陰性樣品GPC色譜圖見圖1（a），加標(biāo)樣品見圖1（b）。由圖1可知，山茶油脂肪等成分在8 min之前完全流出，9種抗氧化劑在8～16 min全部流出。因此，選擇樣品收集時(shí)間為8～16 min。

圖1 9種抗氧化劑在GPC色譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

9種抗氧化劑化合性質(zhì)類似，選擇乙腈作為有機(jī)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分抗氧化劑峰重疊；而甲醇作為有機(jī)相能較好地分離9種抗氧化劑，因此本文選擇甲醇作為有機(jī)相。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水相中加入一定量的甲酸能改善PG和THBP的峰拖尾，趙慧男等[7]也驗(yàn)證了在水相中加入一定比例的甲酸可以改善抗氧化劑的峰型。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇水相為0.5%甲酸水溶液。優(yōu)化后的空白山茶油樣品和加標(biāo)山茶油樣品（10 mg·kg-1）的色譜圖見圖2。

圖2 9種抗氧化劑的色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

在儀器工作條件下對標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，9種抗氧化劑在各自質(zhì)量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.999；以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限，山茶油種9種抗氧化劑在方法檢出限和定量限分別為0.4 ～ 1.0 mg·kg-1和 1.0 ～ 3.0 mg·kg-1，結(jié)果見表 1。

2.4 精密度和回收實(shí)驗(yàn)

在山茶油空白樣品中分別按3.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1、30.0 mg·kg-13水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，以測定回收率，結(jié)果見表2。3個(gè)添加水平下山茶油樣品中9種抗氧化劑的平均回收率為68.9%～97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～4.2%。說明該方法符合山茶油中9種抗氧化劑檢測的檢驗(yàn)方法要求。

表1 9種抗氧化劑在山茶油中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

表2 9種抗氧化劑在山茶油中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.5 樣品分析

按照實(shí)驗(yàn)方法對42批次山茶油進(jìn)行檢測，結(jié)果有兩批次檢出PG，含量分別為46.45 mg·kg-1和57.46 mg·kg-1；2 批次檢出 Ionox-100，含量分別為46.76 mg·kg-1和 54.08 mg·kg-1；9 批 次檢 出 OG， 含量為4.40～44.56 mg·kg-1；4批次檢出DG，含量為21.79～31.23 mg·kg-1，其他抗氧化劑均未檢出。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了凝膠色譜凈化系統(tǒng)對山茶油樣品前處理凈化效果，建立了高效液相色譜法同時(shí)測定山茶油中9種抗氧化劑的分析方法。結(jié)果表明，該方法簡便、靈敏，各檢測指標(biāo)均滿足分析檢測的要求，適用于山茶油中9種抗氧化劑的快速定性、定量分析。