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    TTC在菌落總數(shù)檢測中的應(yīng)用探討

    2022-10-20 09:06:14何芙蓉
    現(xiàn)代食品 2022年17期
    關(guān)鍵詞:蠟樣氏菌芽孢

    菌落總數(shù)反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求,以便對被檢樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價(jià),因而菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣[1]。然而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中,被檢樣品如綠豆糕等在滅菌生理鹽水中并不能完全溶解,導(dǎo)致在培養(yǎng)基中出現(xiàn)與菌落形態(tài)相似的樣品顆粒,使菌落計(jì)數(shù)增加了難度。這對于實(shí)驗(yàn)新人或者經(jīng)驗(yàn)不夠的實(shí)驗(yàn)人員來說,很容易錯把樣品顆粒當(dāng)作菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。但通過查閱資料發(fā)現(xiàn),可以在培養(yǎng)基中添加2,3,5-三苯基氯化四氮唑(又稱TTC)溶液,以區(qū)分平板上生長的菌落與樣品顆粒[2]。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中添加的TTC濃度為5.0 mg/100 mL,但有相關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為TTC濃度在2.0 mg/100 mL時(shí)為最佳[3]?,F(xiàn)將該方法引用至食品檢測中,然后選取TTC濃度在0~5 mg/100 mL,探討TTC在菌落總數(shù)檢測中的適宜濃度。

    1 材料與方法

    1.1 材料與菌種

    綠豆糕:超市自購;大腸埃希氏菌:ATCC25922;鼠傷寒沙門氏菌:ATCC14028;金黃色葡萄球菌:ATCC6538;蠟樣芽孢桿菌:ATCC11778;單核細(xì)胞增生李斯特氏菌:ATCC19115。

    1.2 培養(yǎng)基與試劑

    氯化鈉(廣東光華);2,3,5-三苯基氯化四氮唑(上海麥克林);PCA培養(yǎng)基(陸橋)。

    1.3 儀器與設(shè)備

    高壓滅菌鍋:YXQ-100A(上海博訊);電子天平:BP-622B-X(上海奔普);均質(zhì)器:LC-08(寧波立誠);培養(yǎng)箱:GHP-9160N型(上海一恒);生物安全柜:BSC-1100ⅡA2-X(濟(jì)南鑫貝西);立式冷凍柜:BD-330WEPTU1(青島海爾)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 菌液制備

    從4 ℃冰箱中取出大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的工作菌株,先挑取斜面菌苔于生理鹽水管中做成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?,然后按?0倍系列稀釋法,使菌懸液濃度在104~105CFU·mL-1。

    1.4.2 TTC溶液制備

    取1 g TTC粉末溶于100 mL蒸餾水中,配制成1%TTC溶液,于121 ℃高壓滅菌15 min后冷藏備用。

    1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟

    選擇滅菌后的綠豆糕作為樣品基質(zhì),取25 g樣品加入到225 mL滅菌生理鹽水中,共制備6份。取一份樣品不添加任何菌液,作為樣品空白對照,觀察有無菌落生長。剩余5份樣品分別加入大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌懸液各1 mL。按照10倍系列稀釋法,對以上5份添加了菌懸液的樣品進(jìn)行稀釋。每個樣品各做10組,并編號X0為對照組,X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和 X9為實(shí)驗(yàn)組。

    分別將0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL和0.50 mL配制好的1%TTC溶液加入到冷卻至46 ℃的100 mL PCA瓊脂培養(yǎng)基中,然后傾注到 X0、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9等樣品平皿中并混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板倒置,36 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落結(jié)果并計(jì)數(shù)[4]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TTC對大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)的影響

    由表1可知,與不添加TTC溶液的對照組相比,添加TTC溶液的實(shí)驗(yàn)組隨著TTC濃度的增加,菌落顏色逐漸加深,菌落數(shù)無明顯差異(以lg差絕對值表示)[5-6]。

    表1 TTC對大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)的影響表

    2.2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)的影響

    由表2可知,與不添加TTC溶液的對照組相比,添加TTC溶液的實(shí)驗(yàn)組隨著TTC濃度的增加,菌落顏色逐漸加深,菌落數(shù)無明顯差異。

    表2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)的影響表

    2.3 TTC對金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的影響

    由表3可知,與不添加TTC溶液的對照組相比,隨著TTC濃度的增加,菌落顏色逐漸加深,但是TTC濃度≥3.5 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)較對照組有明顯差異,且TTC濃度為5.0 mg/100 mL時(shí),菌落不生長。

    表3 TTC對金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的影響表

    2.4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)的影響

    由表4可知,與不添加TTC溶液的對照組相比,隨著TTC濃度的增加,菌落顏色逐漸加深,菌落數(shù)無明顯差異,但TTC濃度≥4.0 mg/100 mL時(shí),菌落不生長。

    表4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)的影響表

    2.5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計(jì)數(shù)的影響

    由表5可知,與不添加TTC溶液的對照組相比,隨著TTC濃度的增加,菌落顏色逐漸加深,菌落生長不受影響。

    表5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計(jì)數(shù)的影響表

    3 結(jié)論與討論

    TTC是一種氧化還原指示劑,溶于水中形成無色溶液[7-8]。如果添加TTC的培養(yǎng)基中有細(xì)菌存在,細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將無色的TTC還原為紅色的三苯甲臢,使菌落變成紅色[3]。

    ①在大腸埃希實(shí)驗(yàn)中,TTC濃度為0.5 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無明顯差異,顯淺粉色;TTC濃度在1.0~5.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無差異,菌落顏色由淺紫色到深紫色。②在鼠傷寒沙門氏菌實(shí)驗(yàn)中,TTC濃度為0.5~1.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無明顯差異,菌落顏色顯淺粉色;TTC濃度為1.5~5.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無差異,菌落顏色由淺紫色到深紫色。③在金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)中,TTC濃度為0.5~1.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無明顯差異,菌落顏色顯淺粉色;TTC濃度在1.5~3.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無差異,菌落顏色由淺紫色到深紫色;TTC濃度在3.5~4.0 mg/100 mL時(shí),菌落顏色呈深紫色,但菌落數(shù)與對照組有明顯差異;TTC濃度為5.0 mg/100 mL時(shí),菌落不生長。④在蠟樣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)中,TTC濃度為0.5~3.5 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無差異,菌落顏色由淺粉色到紫色;TTC濃度為4.0~5.0 mg/100 mL時(shí),菌落不生長。⑤在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實(shí)驗(yàn)中,TTC濃度為0.5~1.5 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無明顯差異,菌落顏色為淺粉色;在2.0~5.0 mg/100 mL時(shí),菌落數(shù)與對照組無差異,菌落顏色由淺紫色到深紫色。

    綜上所述,當(dāng)TTC濃度在2.0~3.5 mg/100 mL時(shí),可以既不影響菌落生長,又能使菌落顯色。

    實(shí)驗(yàn)中所選取的大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌均為革蘭氏陰性菌株,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTC的添加對它們的生長影響不大;金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌、蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性桿菌,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTC的添加對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長影響不大,但對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的生長影響很大。所以,TTC濃度對球菌和芽孢菌的生長影響關(guān)系還待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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