酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用技術(shù)

1 原理與分類

1.1 原理

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)也被稱為ELISA技術(shù)，在實(shí)踐應(yīng)用中不僅不會(huì)損壞抗體或抗原的免疫活性，還能提前吸附到被檢測(cè)物體表層。這項(xiàng)技術(shù)的操作過(guò)程分為以下幾點(diǎn)。①包被。利用0.05 mol·L-1pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液，將抗原稀釋到蛋白質(zhì)含量10 g·mL-1，將100 L·well-1添加聚苯乙烯板酶標(biāo)板中，4 ℃保持一整晚，在第2 d清除孔內(nèi)的溶液。②封閉。選用150 L·well-1的封閉液，在43 ℃時(shí)保持40 min，而后清除封閉液。③加樣。加倍比稀釋的酶標(biāo)抗體，100 L·well-1分別添加到對(duì)應(yīng)的板孔中，放置43 ℃孵育40 min。清洗板孔3次，每次3 min。④加底物液顯色。在所有反應(yīng)孔中添加新鮮配制的OPD底物溶液，在室溫狀態(tài)下避光顯色。⑤終止反應(yīng)。添加50 L·well-12 mol·L-1硫酸，其作為終止液可以改變pH數(shù)值。⑥結(jié)果判斷。相比陰性對(duì)照孔，陽(yáng)性孔出現(xiàn)了明顯的顯色反應(yīng)，對(duì)應(yīng)酶標(biāo)抗體的稀釋度是這一抗體的效價(jià)。實(shí)踐操作原理的示意圖如圖1所示。

圖1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)原理圖

1.2 分類

從實(shí)踐發(fā)展角度來(lái)看，ELISA技術(shù)分類并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)踐探究中可以結(jié)合應(yīng)用試劑、標(biāo)準(zhǔn)情況、相關(guān)文獻(xiàn)等得出如下分類。①基于抗體提出的間接法和捕獲法。②基于抗原提出的競(jìng)爭(zhēng)法和雙抗體夾心法。③PCR-ELISA法。④ABS-ELISA法。⑤斑點(diǎn)免疫酶結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

從實(shí)踐應(yīng)用角度來(lái)看，雙抗體夾心法的基本原理是將特異性抗體放在固相載體中，構(gòu)成固相抗體，而后與等待檢驗(yàn)血清中的抗原相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，在經(jīng)過(guò)洗滌后添加酶標(biāo)記抗體，能和免疫復(fù)合物中的抗原相結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體的復(fù)合物，在添加底物顯色之后，準(zhǔn)確判斷抗原的含量。具體操作流程如圖2所示。

圖2 雙抗體夾心法的流程圖

2 在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的具體方向

從本質(zhì)上講，ELISA是指一種借助酶進(jìn)行催化反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，需要在全面了解抗原和抗體的基本反應(yīng)原理后，著重分析各類物品的高度特異性。在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，抗原與抗體會(huì)被吸附到被檢測(cè)物體表面，同時(shí)保障自身的免疫活性，而后通過(guò)比較檢測(cè)期間的復(fù)合物生成量和待測(cè)抗原、待測(cè)抗體之間的各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，不僅操作時(shí)間短且靈敏度高，還可以盡快得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，持續(xù)優(yōu)化實(shí)際檢驗(yàn)的操作質(zhì)量。因此，這項(xiàng)技術(shù)一經(jīng)提出就在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用，實(shí)踐技術(shù)應(yīng)用方向體現(xiàn)在以下3方面[1-2]。

2.1 檢測(cè)農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)業(yè)種植過(guò)程中使用農(nóng)藥之后導(dǎo)致原料、半成品或成品中存在有毒農(nóng)藥殘留，比較常見(jiàn)的有代謝物、降解物等。現(xiàn)如今，我國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)發(fā)展水平越來(lái)越快，相關(guān)工作人員逐步優(yōu)化了農(nóng)藥殘留的檢測(cè)水平，這對(duì)加強(qiáng)我國(guó)食品安全管理具有積極影響。其中，ELISA技術(shù)主要廣泛運(yùn)用在除蟲菊酯類、有機(jī)磷類等農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作中，并在實(shí)踐中取得了優(yōu)異成績(jī)。例如，有機(jī)磷類農(nóng)藥殺蟲范圍更廣，作用方式更多，對(duì)人類和牲畜的危害較大，相關(guān)研究人員運(yùn)用ELISA技術(shù)和流動(dòng)注射分析技術(shù)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其具有識(shí)別性高、靈敏度強(qiáng)等特征，這就證明能在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中優(yōu)先選擇ELISA技術(shù)。

2.2 檢測(cè)非食用物質(zhì)

現(xiàn)如今，為了增加食品的儲(chǔ)存時(shí)間，豐富食品的使用方式，商家開(kāi)始大量運(yùn)用添加劑，而這也是引發(fā)食品安全的主要因素。例如，蘇丹紅、三聚氰胺等事件，都是極具代表性且影響范圍極廣的食品安全問(wèn)題。在大范圍爆發(fā)食品安全事件后，人們?cè)谠桨l(fā)重視食品安全檢測(cè)工作的同時(shí)，加強(qiáng)了相關(guān)技術(shù)的探討力度，主要開(kāi)始對(duì)食品加工和生產(chǎn)中的非食用物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，從基礎(chǔ)上保障食品安全質(zhì)量[3]。例如，蘇丹紅染料具備潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此各國(guó)政府在保障食品安全的相關(guān)條例中提出，禁止添加蘇丹紅染料，并為了進(jìn)一步保障食品安全的可靠性，在實(shí)踐探究中提出了間接競(jìng)爭(zhēng)性的ELISA技術(shù)，最終研究結(jié)果證明，這種方法的應(yīng)用效率較高，檢測(cè)樣本數(shù)量較大，實(shí)踐成本支出較少，在研究分析食品當(dāng)中的蘇丹紅I具有可行性和科學(xué)性；而三聚氰胺作為有機(jī)化工產(chǎn)品，屬于生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的基礎(chǔ)原料，在目前市場(chǎng)中的應(yīng)用范圍非常廣闊。

2.3 檢測(cè)生物毒素

河豚毒素主要存在于海洋生物體內(nèi)，其中最具代表性的就是河豚。該類毒素的毒性比氰化鈉大1 000倍，0.5 mg即可致人死亡，是現(xiàn)階段食品安全檢測(cè)領(lǐng)域人員的關(guān)注重點(diǎn)。雖然我國(guó)明令禁止銷售河豚魚類，但因?yàn)闆](méi)有提出統(tǒng)一的檢測(cè)方法，實(shí)際行業(yè)的監(jiān)管措施不完善，河豚魚類中毒事件頻繁發(fā)生，最終致死率可以達(dá)到60%，至今沒(méi)有生產(chǎn)出特效抗毒藥[4]。相關(guān)學(xué)者在實(shí)踐探究中提出運(yùn)用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù)對(duì)河豚毒素進(jìn)行快速檢驗(yàn)。這種方法需要利用碘酸鈉氧化法合成酶標(biāo)記抗原，并對(duì)合成后的酶標(biāo)記抗原進(jìn)行檢測(cè)分析，判斷其和抗海豚毒素單克隆抗體之間的特異性反應(yīng)，由此構(gòu)建全新的ELISA方法。經(jīng)過(guò)實(shí)踐探究發(fā)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)操作起來(lái)更加方便快捷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，在進(jìn)一步深層探究中可以開(kāi)發(fā)制造相關(guān)試劑盒。

3 技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

3.1 現(xiàn)存問(wèn)題及解決策略

3.1.1 現(xiàn)存問(wèn)題

雖然ELISA技術(shù)具有快速廉價(jià)、靈敏度高等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，在實(shí)踐發(fā)展中已經(jīng)成為食品安全檢測(cè)分析的首選，但也存在較多問(wèn)題，具體體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)。①制備抗體較為困難。②對(duì)試劑的選擇性較高。③無(wú)法同時(shí)分析多種成分，結(jié)構(gòu)類似的化合物很容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

3.1.2 解決策略

為了有效解決上述問(wèn)題，各國(guó)學(xué)者在實(shí)踐探究中提出了以下對(duì)策。①要根據(jù)等待檢測(cè)物質(zhì)的基本特征，整合多門學(xué)科知識(shí)，引入立體化學(xué)設(shè)計(jì)理論、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、組合化學(xué)等內(nèi)容，構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的評(píng)價(jià)模型，以此提升技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率，并得到親和性更高的免疫源性的重組抗原。②在存在多個(gè)檢測(cè)目標(biāo)的情況下，依據(jù)條件控制抗原針對(duì)某一類物質(zhì)構(gòu)成特異抗體，最終可以在一次實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)檢測(cè)不同物質(zhì)的總體數(shù)量。

3.2 未來(lái)展望

分析當(dāng)前食品安全檢測(cè)發(fā)展情況可知，相比其他檢測(cè)技術(shù)，ELISA技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、靈敏度強(qiáng)、檢測(cè)過(guò)程安全可靠等優(yōu)勢(shì)，且能一次性處理大批量樣品，因此非常適合篩選性實(shí)驗(yàn)操作。需要注意的是這類技術(shù)也存在較多問(wèn)題，如不能檢測(cè)包含多種成分的食物、應(yīng)用試劑具有一定的選擇性、在處理結(jié)構(gòu)類似的化合物時(shí)要進(jìn)行適宜的交叉反應(yīng)等[5]。因此，科研學(xué)者在實(shí)踐探究中提出將該技術(shù)與其他檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行整合運(yùn)用，這樣既可以降低交叉反應(yīng)，又可以提高檢測(cè)的靈敏度。

相比其他技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)設(shè)備技術(shù)的要求不高，實(shí)踐支出成本更低，技術(shù)靈敏度更準(zhǔn)確，最終試劑保存時(shí)間較長(zhǎng)。因此，要在全面了解食品安全管理現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的應(yīng)用原理和優(yōu)缺點(diǎn)，合理運(yùn)用到不同類型的食品安全檢測(cè)工作中。同時(shí)，要全面開(kāi)發(fā)效率高和性能強(qiáng)的重組抗原，結(jié)合實(shí)證案例分析標(biāo)記測(cè)定方法，并將媒體外定向進(jìn)化運(yùn)用到實(shí)踐檢測(cè)工作中，由此獲取多樣化的測(cè)定儀器設(shè)備，這樣既可以提升實(shí)踐檢測(cè)水平，保障檢測(cè)工作的穩(wěn)定性，又可以進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍，為保障我國(guó)食品安全奠定基礎(chǔ)條件。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和科學(xué)技術(shù)的不斷提升，城市居民的生活質(zhì)量越來(lái)越高，人們?cè)谥匾暿称钒踩珯z測(cè)工作的同時(shí)，對(duì)食品安全檢測(cè)提出了更簡(jiǎn)便快捷的要求。相比其他檢測(cè)方式，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的結(jié)果更加準(zhǔn)確，樣品處理數(shù)量更大，但依舊存在較多問(wèn)題，如無(wú)法提高試劑的選擇性、無(wú)法進(jìn)行多殘留分析、結(jié)構(gòu)類似的化合物會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)等。但隨著多種技術(shù)理論的整合應(yīng)用，新的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在實(shí)踐探究中取得了優(yōu)異成績(jī)，相信其在未來(lái)食品安全管理中必然可以繼續(xù)發(fā)揮重要作用。