基于生物信息學分析微小染色體維持蛋白2在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達及意義

黃舒婷溫 炬江奕恒秦 思

1.廣東省第二人民醫(yī)院民航院區(qū)門診部，廣東廣州 510405；2.廣東省第二人民醫(yī)院皮膚性病科，廣東廣州 510317

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界上第六大常見癌癥類型，每年約有80余萬例新增確診患者，死亡率占所有惡性腫瘤的1%～2%，在我國，每年新增22.5萬例，死亡10.3萬例。由于HNSCC發(fā)病部位特殊，臨床特征不明顯，往往患者確診時已處于晚期，而晚期HNSCC常易發(fā)生轉移。目前，臨床上對頭頸部腫瘤的診斷主要依靠影像學檢查，容易發(fā)生漏診。微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是參與真核細胞DNA復制啟始和延長調控的關鍵蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌等疾病中有重要意義，但在HNSCC中研究甚少。本研究通過生物信息學技術探究MCM2在HNSCC中的表達，為HNSCC的診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 MCM2作為差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）的鑒定

運用基因表達公共（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載GSE2379和GSE23036數(shù)據(jù)集，共包含99個HNSCC樣本和31個正常樣本，并定義|logFC|＞1且調整后的P值＜0.05的基因為DEG。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析

運用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的UALCAN網站可在線分析多種惡性腫瘤的臨床數(shù)據(jù)，獲取特定基因在不同組織中的表達情況。本實驗通過分析UALCAN網站的數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 9.3.1軟件對數(shù)據(jù)重新可視化，探討不同因素下正常組織和HNSCC樣本中MCM2的表達情況及意義。

1.3 TIMER數(shù)據(jù)庫免疫分析

腫瘤免疫評估資源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫是一個基于TCGA數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)分析不同癌癥類型免疫細胞浸潤的網站，通過該數(shù)據(jù)庫分析HNSCC中MCM2與多種免疫細胞的相關性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 關鍵基因的篩選和構建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡

Linked Omics數(shù)據(jù)庫收集了32種TCGA癌癥類型和10種臨床蛋白組學腫瘤的多組學數(shù)據(jù)，在該數(shù)據(jù)庫中利用Pearson檢驗分析并篩選出與MCM2密切相關的前5個正相關基因作為關鍵基因，運用STRING數(shù)據(jù)庫分析以上基因的PPI網絡。

1.5 GSCALite數(shù)據(jù)庫分析

GSCALite數(shù)據(jù)庫是用于基因表達、單核苷酸變異，甲基化，通路活性和藥物敏感性等分析的平臺，使用該數(shù)據(jù)庫對MCM2及其相關關鍵基因的藥物敏感性進行分析。

2 結果

2.1 MCM2在HNSCC中的表達

數(shù)據(jù)集GSE2379和GSE23036中，MCM2在HNSCC腫瘤組織中的表達均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A）。通過篩選DEG并繪制火山圖（圖1B），觀察到MCM2是一個上調的DEG，提示MCM2在HNSCC中高表達并在致癌性中起作用。

圖1 MCM2在GEO數(shù)據(jù)庫中的表達

2.2 HNSCC患者中不同因素對MCM2表達的影響

不同年齡段HNSCC中MCM2的表達均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），41～60歲組別MCM2的表達量最高。不同性別HNSCC中MCM2表達均高于正常組織，且男性患者高于女性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同腫瘤分級HNSCC中MCM2表達均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腫瘤分化越差者，MCM2表達水平越高。不同臨床分期HNSCC中MCM2表達均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而不同臨床分期HNSCC 的MCM2表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同分級淋巴轉移的HNSCC中MCM2表達高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但MCM2的表達與腫瘤轉移程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染與否的HNSCC中MCM2表達均高于正常組織，且HPV陽性患者MCM2表達高于HPV陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫中的MCM2表達量比較

2.3 HNSCC中MCM2的表達與免疫細胞的關系

TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示，HNSCC中MCM2與B細胞、CD8T細胞、CD4T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平均成正相關（P＜0.05）（圖3）。

圖3 MCM2與常見免疫細胞的相關性分析

2.4 HNSCC中關鍵基因的共表達分析

Linked Omics數(shù)據(jù)庫篩選出與MCM2顯著正相關的前5個基因作為關鍵基因，包括微小染色體維持蛋白6（minichromosome maintenance complex component 6，MCM6）、微小染色體維持蛋白5（minichromosome maintenance complex component 5，MCM5）、無齒E3泛素蛋白連接酶同源物（Denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL）、晝夜節(jié)律調節(jié)蛋白（timeless circadian regulator，TIMELESS）和DNA聚合酶θ （DNA polymerase theta，POLQ）。利用STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI網絡分析（圖4）。

圖4 MCM2的共表達基因

2.5 MCM2對癌癥相關調節(jié)藥物的影響

通過分析6個關鍵基因的藥物相關性，發(fā)現(xiàn)MCM2對曲美替尼、司美替尼和RDEA119等藥物耐受，對NPK76-II-72-1、Navitoclax、GSK1070916和I-BET-762等分子類藥物敏感（圖5）。

圖5 關鍵基因與藥物的相關性

3 討論

本實驗通過GEO數(shù)據(jù)庫多數(shù)據(jù)集分析顯示，HNSCC中MCM2的表達較正常組織異常增高，且在不同年齡組別、性別、腫瘤分級、臨床分期和有無淋巴轉移情況的HNSCC中MCM2均顯著升高。蔡開貴等通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MCM2的表達與人喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）的病理分級、臨床分期和淋巴結轉移成正相關。但也有研究發(fā)現(xiàn)與早期LSCC相比，晚期喉癌患者MCM2的表達水平顯著降低。本研究提示HNSCC中MCM2的異常表達與HPV感染情況有關聯(lián)，王鯤鵬等研究發(fā)現(xiàn)MCM2可能是HPV陽性HNSCC診斷及預后的標志物。以上結果表明，MCM2異常表達與HNSCC疾病的嚴重程度和癌癥進程有關。

不同類型的免疫浸潤細胞可通過直接或間接相互作用調節(jié)癌細胞的生長和轉移，然而，MCM2與HNSCC腫瘤免疫浸潤細胞的關系至今尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)MCM2與多種免疫細胞的浸潤水平密切相關，提示MCM2調控頭頸部鱗癌患者的免疫狀態(tài)，影響腫瘤的進展。此外，MCM2是口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生存率下降的獨立危險因素。Kodani等發(fā)現(xiàn)中分化OSCC具有更高的MCM2標記指數(shù)，與患者的預后相關。

研究發(fā)現(xiàn)MCM2可被多種藥物抑制，考慮MCM2是治療HNSCC的潛在治療靶點。Ahmadinejad等研究表明抗凋亡蛋白抑制劑（Navitoclax）可干擾抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的相互作用，激活后者誘導細胞死亡。聯(lián)合Navitoclax治療較單用順鉑治療，能有效防止HNSCC的復發(fā)。GSK1070916為極光激酶B/C抑制劑，靶向作用于有絲分裂突變信號通路，可消除轉移的慢性粒細胞白血病和急性髓性白血病而不損傷卵巢組織，防止白血病的復發(fā)。I-BET-762是一種新的溴域抑制劑，可逆地靶向作用于溴結構域和超末端結構域（bromodomain and extra terminal domain，BET）蛋白，削弱其與組蛋白上的乙酰化賴氨酸結合的能力，阻斷下游轉錄。Zhang等發(fā)現(xiàn)I-BET-762可延遲乳腺癌和肺癌臨床發(fā)病前期的腫瘤發(fā)展，誘導腫瘤細胞生長阻滯，在癌癥的預防治療上有廣闊的應用前景。NPK76-II-72-1目前尚無相關文獻的報道，且GSK1070916和I-BET-762在HNSCC的相關文獻中均無研究，是未來研究HNSCC治療靶點的新方向。

綜上所述，頭頸部腫瘤病灶部位和病理類型多，解剖關系復雜，生物靶點為其臨床診斷和靶向免疫治療提供了新思路。本研究提示MCM2是頭頸部鱗狀細胞癌潛在的腫瘤標記物和治療靶點。