海星皂苷類(lèi)化合物抗腫瘤分子對(duì)接研究

陳 寧，唐祉娟，劉 冰*，肖 迪，王貞妮

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

海星又名星魚(yú)，屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodemata)、海星綱(Asteroidea)。海星含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、鈣、鐵、磷等常規(guī)物質(zhì)，還含有海星皂苷、海星皂素等具有特殊功效的物質(zhì)。因海星中不飽和脂肪酸的含量比陸地動(dòng)物高很多，適合老年人適量食用，可增強(qiáng)記憶力、健腦益智；且海星大部分成分都是蛋白質(zhì)，分解后與人體的氨基酸比例很接近，適合體質(zhì)虛弱的人適量食用，可起到補(bǔ)虛健體的功效。海星味咸且性平，具有厚腸止瀉、安神、和胃止痛等作用[1-3]，主要用于治療甲狀腺腫、胃痛胃酸、腹瀉、癲癇等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，海星中含有皂苷、甾醇、生物堿等多種活性成分，具有抗腫瘤、降糖等多種生物活性[5-9]，在海洋中藥和保健食品的開(kāi)發(fā)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10-11]。近年來(lái)，關(guān)于海星甾體化合物的提取及活性研究較多，尤其是對(duì)海星皂苷的研究[12]。趙君等[13]從海星殼的水提液中分離純化出水溶性海星皂苷，體外抗腫瘤活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所得皂苷純品對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、宮頸癌細(xì)胞HeLa、肺癌細(xì)胞A-549和肝癌細(xì)胞Bel-7402均具有顯著的抑制活性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)的含鋅內(nèi)肽酶，介導(dǎo)結(jié)締組織大分子的降解。哺乳動(dòng)物的MMPs家族至少由20種酶組成，根據(jù)底物特異性和結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)分為4個(gè)亞類(lèi)[14]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)構(gòu)成MMPs家族中的明膠酶。在惡性腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的情況下，MMP-2和MMP-9具有降解基底膜和其它基質(zhì)成分的能力。通過(guò)基因調(diào)控或藥物作用降低MMP-9活性的干預(yù)可影響腫瘤細(xì)胞，因此，降低MMP-9活性可能是抗腫瘤的關(guān)鍵機(jī)制。由于MMPs在重建結(jié)締組織模型中的核心作用，研究人員對(duì)其作為廣泛退行性和炎癥性疾病(如關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化)治療干預(yù)的靶點(diǎn)產(chǎn)生了極大興趣。根據(jù)MMP-9的結(jié)構(gòu)能夠?yàn)檫@一重要的抗腫瘤靶點(diǎn)設(shè)計(jì)有效和特異的抑制劑[15]。

作者通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)收集海星皂苷類(lèi)化合物，建立小分子配體庫(kù)，基于MMP-9的晶體結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接技術(shù)篩選出與MMP-9有較強(qiáng)結(jié)合作用的海星皂苷類(lèi)化合物，并通過(guò)Western blot檢測(cè)海星皂苷類(lèi)化合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的MMP-9蛋白表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 技術(shù)平臺(tái)

蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(RSCB PDB http://www.rcsb.org)，小分子化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(SciFinder)，Pymol軟件，AutoDock Vina分子對(duì)接程序。所有計(jì)算均在DELLT5820上執(zhí)行。

1.2 小分子配體庫(kù)的建立

海星皂苷類(lèi)化合物從SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)[16-33]中獲得，利用Chem3D軟件將其轉(zhuǎn)換為mol2格式。對(duì)全部小分子配體，用分子程序MM2的最小能量模塊進(jìn)行優(yōu)化，得到的穩(wěn)定優(yōu)勢(shì)構(gòu)象以mol2格式保存。利用Penbabel軟件對(duì)mol2格式的小分子配體進(jìn)行批量加工，并轉(zhuǎn)換成pdbqt格式保存。

1.3 對(duì)接參數(shù)的確定

使用分子模擬軟件Sybyl進(jìn)行分子對(duì)接研究，探討海星皂苷類(lèi)化合物與MMP-9的作用模式。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到MMP-9的晶體結(jié)構(gòu)。使用Notepad去除反異羥肟酸酯抑制劑和HOH等小分子，加入氫氣，計(jì)算點(diǎn)電荷并設(shè)置原子類(lèi)型，根據(jù)受體蛋白復(fù)合物中的配體和活性口袋確定對(duì)接活性部位和對(duì)接參數(shù)，保存加工后的蛋白。

1.4 分子對(duì)接

使用AutoGrid計(jì)算能量格點(diǎn)，根據(jù)原配體的坐標(biāo)文件設(shè)置Grid Box中心坐標(biāo)為：MMP-9(1GKC)：60.455、25.057、113.976，共有50×50×50個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)的距離為0.037 5 nm。使用AutoDock搜索網(wǎng)格范圍內(nèi)受體，采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行構(gòu)象搜索，能量評(píng)定最大次數(shù)為2 500 000，每個(gè)小分子配體都設(shè)定得到9個(gè)構(gòu)象，計(jì)算CPU選擇為10，其它參數(shù)選擇默認(rèn)值。運(yùn)行AutoGrid進(jìn)行網(wǎng)格點(diǎn)中相關(guān)能量的計(jì)算[34-36]。

使用AutoDock Vina[34-35]對(duì)MMP-9活性中心進(jìn)行配體庫(kù)的構(gòu)象搜索，采用AutoDock 4.2搜索算法進(jìn)行半柔性對(duì)接[37]。

1.5 數(shù)據(jù)與作用模式分析

采用Pymol軟件進(jìn)行分子對(duì)接打分及作用模式分析。

1.6 Western blot檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(5×106個(gè))，用PBS緩沖液洗滌1次，分別加入劑量為7 μmol·L-1、14 μmol·L-1、21 μmol·L-1的化合物28/40/44，培養(yǎng)48 h；細(xì)胞裂解物立即于95 ℃下變性10 min；將細(xì)胞裂解液(25 μL)裝載到7.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并在0.192 mol·L-1甘氨酸、0.025 mol·L-1Tris和20%甲醇中轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，冰上轉(zhuǎn)膜1.5 h，用pH值7.5的5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBS緩沖液/0.05%吐溫20溶液洗滌3次，每次15 min；用TBST緩沖液按1∶200比例稀釋?zhuān)辉儆肨BS緩沖液/0.05%吐溫20溶液洗滌3次，每次15 min，斑點(diǎn)消失，在室溫下用1∶10000稀釋的過(guò)氧化物酶結(jié)合二級(jí)抗體；用TBS緩沖液/吐溫20溶液洗滌3次后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參比進(jìn)行顯色及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小分子配體庫(kù)的構(gòu)建

從SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)獲得60個(gè)海星皂苷類(lèi)化合物，構(gòu)建小分子配體庫(kù)，其中與MMP-9對(duì)接效果較好的30個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 與MMP-9對(duì)接效果較好的30個(gè)海星皂苷類(lèi)化合物Fig.1 Thirty starfish saponins with good docking effect to MMP-9

2.2 對(duì)接方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

采用反異羥肟酸酯抑制劑與MMP-9進(jìn)行對(duì)接，驗(yàn)證AutoDock 4.2參數(shù)設(shè)置的準(zhǔn)確性。將MMP-9(1GKC)結(jié)構(gòu)活性中心所結(jié)合的反異羥肟酸酯抑制劑取出作為配體，與刪去了此配體的MMP-9(1GKC)重新對(duì)接(圖2)。結(jié)果顯示，對(duì)接結(jié)合自由能最低為-8.9 kcal·mol-1，其均方根偏差RMSD值為1.99(一般認(rèn)為RMSD值<2，配體與受體可有效對(duì)接[33-34])，可見(jiàn)反異羥肟酸酯抑制劑已成功嵌入MMP-9表面的活性中心，表明本實(shí)驗(yàn)的參數(shù)設(shè)置合適，能較合理地模擬抑制劑與酶在活性中心的結(jié)合構(gòu)象，對(duì)接方法可信[38]。

圖2 反異羥肟酸酯抑制劑與MMP-9的對(duì)接模式

2.3 分子對(duì)接打分

將60個(gè)海星皂苷類(lèi)化合物與MMP-9對(duì)接，其中對(duì)接效果較好(對(duì)接打分<-7)的30個(gè)化合物的打分結(jié)果列于表1。

表1 海星皂苷類(lèi)化合物與MMP-9的對(duì)接打分

2.4 分子對(duì)接作用模式分析

采用AutoDock和Pymol軟件分析60個(gè)海星皂苷類(lèi)化合物與MMP-9的對(duì)接模式。發(fā)現(xiàn)在MMP-9活性中心的氨基酸殘基中，Gly186、Leu188、His401、His405、His411、Pro421有可能與海星皂苷苷元結(jié)構(gòu)中的羰基、羥基及糖上的羥基形成氫鍵，從而在對(duì)接時(shí)發(fā)揮重要作用，尤其是His401、His411、Pro421側(cè)鏈上的O原子和N原子很容易與海星皂苷小分子配體相互作用形成氫鍵。另外，非結(jié)合相互作用(如范德華力和靜電相互作用)在MMP-9活性中心與海星皂苷小分子配體之間形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象方面也起著非常重要的作用。海星皂苷類(lèi)化合物3、14、28、40、42、44與MMP-9具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，它們進(jìn)入MMP-9活性中心的關(guān)鍵口袋，并與關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用(圖3)。

圖3 海星皂苷類(lèi)化合物3、14、28、40、42、44與MMP-9的對(duì)接模式Fig.3 Docking mode of starfish saponins 3,14,28,40,42,and 44 with MMP-9

2.5 海星皂苷類(lèi)化合物28、40、44對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的MMP-9蛋白表達(dá)的影響(圖4)

從圖4可以看出，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在給藥(海星皂苷類(lèi)化合物28、40、44，用量10 μg·mL-1)48 h后，MMP-9蛋白表達(dá)量明顯減少。

圖4 海星皂苷類(lèi)化合物28、40、44對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of starfish saponins 28,40,and 44 on expression of MMP-9 protein in human breast cancer cells MCF-7

3 結(jié)論

通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)收集海星皂苷類(lèi)化合物，建立小分子配體庫(kù)，基于MMP-9的晶體結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接技術(shù)篩選出與MMP-9有較強(qiáng)結(jié)合作用的海星皂苷類(lèi)化合物3、14、28、40、42、44，它們是海星發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵化合物；通過(guò)Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)海星皂苷類(lèi)化合物28、40、44可使人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的MMP-9蛋白表達(dá)量減少。為海星抗腫瘤作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。