蒙脫土對(duì)碳酸鹽生物誘導(dǎo)過程的影響

李 坤，肖 盟

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

粘土作為水體沉積物中的重要組成部分，對(duì)藻細(xì)胞具有一定的聚集作用，可形成10～100 μm的藻細(xì)胞聚集體，然后快速沉降到水體底部沉積物中[10]，避免被微型浮游動(dòng)物及其它掠食者捕食，且在水體底部缺氧條件下聚集體有機(jī)質(zhì)可以有效保存[11]。聚集體的沉降速度隨著聚集體粒徑的增大而加快[12]，而碳酸鹽在聚集體周圍的礦化能夠增加聚集體的質(zhì)量，加快沉降速度，對(duì)聚集體有機(jī)質(zhì)的保存也起到了一定的促進(jìn)作用。

目前，研究者對(duì)碳酸鹽的生物誘導(dǎo)過程研究較多，但對(duì)環(huán)境因素的考察還較少，如粘土礦物對(duì)碳酸鹽生物誘導(dǎo)過程的影響尚未見報(bào)道?；诖?，作者在蒙脫土作用下利用聚球藻誘導(dǎo)碳酸鹽礦化，測(cè)定pH值、葉綠素a含量、碳酸酐酶活性，分析碳酸鹽礦物的組成和形貌，探討蒙脫土對(duì)碳酸鹽生物誘導(dǎo)過程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、培養(yǎng)基與儀器

蒙脫土(粒徑約2.5 μm)，中國(guó)麥克林；聚球藻(Synechococcussp.)，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

BG11培養(yǎng)基(g·L-1)：NaNO31.5，K2HPO4·3H2O 0.040，檸檬酸鐵銨 0.006，檸檬酸0.006，EDTA 0.001，H3BO32.86,MnCl2·4H2O 1.81,ZnSO4·7H2O 0.222,CuSO4·5H2O 0.079,NaMoO4·2H2O 0.39,Co(NO3)2·6H2O 0.049 4,Ca(CH3COO)2·H2O 7.91,Mg(CH3COO)2·4H2O 10.67[13];pH值7.0，105 ℃高壓滅菌30 min。所用試劑均為市售分析純。

752型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；安捷倫5110型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，美國(guó)安捷倫公司；D8 ADVANCE型X-射線衍射儀，德國(guó)Bruker；FEI NanoSEM 450型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，美國(guó)FEI公司。

1.2 聚球藻對(duì)碳酸鹽的誘導(dǎo)礦化實(shí)驗(yàn)

分別向BG11培養(yǎng)基中加入不同量(0 mg·L-1、5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1)的蒙脫土，再按10%接種量接種擴(kuò)培后的聚球藻(OD680=0.7)，在光照強(qiáng)度為2 000 Lux、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1、溫度為25 ℃、光暗周期為12 h∶12 h的條件下培養(yǎng)12 d。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.1 聚球藻生理生化性能的測(cè)定

每隔48 h取樣測(cè)定pH值、葉綠素a含量(表征藻細(xì)胞濃度[14])、碳酸酐酶活性，考察蒙脫土對(duì)聚球藻生理生化性能的影響。

采用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。

葉綠素a含量的測(cè)定：將各樣品靜置30 min，取上層培養(yǎng)液5 mL于3 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；加入等體積丙酮于4 ℃下靜置24 h，離心，取上清液，分別測(cè)定649 nm、665 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算葉綠素a含量(mg·L-1)：

葉綠素a含量=12.47A665-3.62A649

(1)

碳酸酐酶活性的測(cè)定[15]：將0.013 9 g對(duì)硝基苯酚溶解于100 mL磷酸鹽緩沖液中，配制1 mmol·L-1對(duì)硝基苯酚溶液，4 ℃下保存。分別取0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL對(duì)硝基苯酚溶液置于試管中，加蒸餾水至3 mL，測(cè)定各溶液在400 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將0.018 1 g醋酸對(duì)硝基苯酚溶解于0.5 mL無(wú)水乙醇中制成工作液Ⅰ，將0.156 0 g二乙基丙二酸二乙酯溶解于99.5 mL磷酸鹽緩沖液中制成工作液Ⅱ，將工作液Ⅰ與工作液Ⅱ混合制成工作液Ⅲ；將1.5 mL工作液Ⅲ和1.5 mL培養(yǎng)液混合，測(cè)定混合液在400 nm處吸光度(A0)；再將混合液置于35 ℃水浴中，30 min后測(cè)定混合液在400 nm處吸光度(A1)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算對(duì)硝基苯酚的初始濃度(c0，μmol·L-1)和最終濃度(c1，μmol·L-1)。按式(2)計(jì)算碳酸酐酶活性(U·L-1，每分鐘每升培養(yǎng)液釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為1 U)：

(2)

1.2.2 藻細(xì)胞聚集率的測(cè)定

于20 mL離心管中加入10 mL擴(kuò)培后的聚球藻(OD680=0.7)，分別加入5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1的蒙脫土，以不加蒙脫土為對(duì)照，于搖床中120 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h后取出，2 500 r·min-1離心1 min，取上清液，按1.2.1方法測(cè)定葉綠素a含量(ca)，按式(3)計(jì)算藻細(xì)胞聚集率(%)：

(3)

1.2.3 鎂鈣比的測(cè)定

1.2.4 碳酸鹽礦物組成與形貌的分析

將加入50 mg·L-1蒙脫土的培養(yǎng)液于5 500 r·min-1離心10 min，將沉淀物冷凍干燥，采用X-射線衍射儀測(cè)定碳酸鹽礦物組成；將沉淀物用體積分?jǐn)?shù)10%的H2O2浸泡去除有機(jī)質(zhì)，蒸餾水洗滌，70 ℃干燥10 h，采用掃描電鏡觀察碳酸鹽礦物形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒙脫土對(duì)聚球藻生理生化性能的影響

在培養(yǎng)基中加入不同量的蒙脫土，測(cè)定pH值、葉綠素a含量、碳酸酐酶活性，考察蒙脫土對(duì)聚球藻生理生化性能的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蒙脫土對(duì)聚球藻生理生化性能的影響Fig.1 Effect of montmorillonite on physiological and biochemical characteristics of Synechococcus sp.

由圖1可以看出:(1)蒙脫土對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響不大，加入蒙脫土和未加蒙脫土?xí)r，培養(yǎng)液pH值的變化規(guī)律一致，均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，最后穩(wěn)定在8.5左右。(2)蒙脫土對(duì)培養(yǎng)液葉綠素a含量的影響顯著，未加蒙脫土?xí)r，葉綠素a含量在培養(yǎng)8 d時(shí)達(dá)到最高；而加入5 mg·L-1或50 mg·L-1蒙脫土后，葉綠素a含量在培養(yǎng)6 d即可達(dá)到最高，且葉綠素a含量最高值隨蒙脫土加量的增加逐漸降低，在蒙脫土加量為500 mg·L-1時(shí)葉綠素a含量最低。表明蒙脫土加量的增加會(huì)引起聚球藻細(xì)胞的大量聚集，從而減少了水體中聚球藻的數(shù)量并限制了聚球藻的生長(zhǎng)。(3)蒙脫土對(duì)培養(yǎng)液碳酸酐酶活性的影響不大，加入蒙脫土和未加蒙脫土?xí)r，培養(yǎng)液碳酸酐酶活性的變化規(guī)律整體一致，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低隨后再升高再降低，在培養(yǎng)6 d時(shí)達(dá)到最高，且碳酸酐酶活性最高值隨蒙脫土加量的增加整體呈降低趨勢(shì)，在蒙脫土加量為500 mg·L-1時(shí)碳酸酐酶活性最低。綜上表明，蒙脫土的加入，會(huì)導(dǎo)致聚球藻細(xì)胞的聚集，從而對(duì)碳酸酐酶活性有一定的抑制作用，且該抑制作用隨著蒙脫土加量的增加整體逐漸增強(qiáng)。

2.2 蒙脫土對(duì)聚球藻細(xì)胞的聚集作用

按1.2.2方法測(cè)定蒙脫土加量分別為5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1時(shí)的藻細(xì)胞聚集率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 蒙脫土對(duì)藻細(xì)胞聚集率的影響Fig.2 Effect of montmorillonite on aggregation rate of Synechococcus sp.cells

由圖2可以看出，蒙脫土對(duì)聚球藻具有一定的聚集作用，蒙脫土加量越多，聚集效果越好。這是因?yàn)?，?yáng)離子橋鍵和靜電斥力的綜合作用是聚球藻細(xì)胞在蒙脫土表面吸附的主要原因；由于粘土礦物顆粒表面常帶負(fù)電荷，電荷零點(diǎn)為3.6[16]，而微生物表面含有羧基、磷酰基、氨基等功能基團(tuán)，總體上也帶負(fù)電荷[17]，因此，蒙脫土與聚球藻之間存在靜電斥力；但聚球藻產(chǎn)生的部分胞外多糖由糖醛酸組成，糖醛酸是陰離子糖，可以與帶負(fù)電荷的蒙脫土顆粒形成陽(yáng)離子橋鍵，進(jìn)而克服勢(shì)能障礙[18]并最終聚集。

2.3 蒙脫土對(duì)鎂鈣比的影響

4組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液中Ca2+、Mg2+濃度及鎂鈣比結(jié)果如圖3所示。

圖3 蒙脫土對(duì)鎂鈣比的影響Fig.3 Effect of montmorillonite on magnesium calcium ratio

由圖3可以看出：(1)對(duì)照組Ca2+、Mg2+濃度分別為1 961.1 mg·L-1、1 156.1 mg·L-1，加入蒙脫土后，Ca2+、Mg2+濃度分別降至1 849.9 mg·L-1、1 095.6 mg·L-1，吸附率分別為5.67%和5.23%，說明，蒙脫土對(duì)Ca2+、Mg2+均具有一定的吸附作用，但吸附率相差不大。(2)當(dāng)在體系中加入聚球藻后，Ca2+、Mg2+濃度均顯著降低，其中Ca2+濃度降幅較大，聚球藻組Ca2+濃度從1 961.1 mg·L-1降至933.9 mg·L-1，降低52.38%，推斷主要源于聚球藻對(duì)Ca2+的礦化；聚球藻+蒙脫土組Ca2+濃度降至923.3 mg·L-1，降低52.92%，表明蒙脫土對(duì)Ca2+的礦化無(wú)明顯影響。對(duì)于Mg2+濃度，聚球藻組Mg2+濃度從1 156.1 mg·L-1降至1 033.7 mg·L-1，降低10.59%，主要源于聚球藻的礦化作用；聚球藻+蒙脫土組Mg2+濃度降至953.2 mg·L-1，降低17.55%。加入聚球藻后，Mg2+濃度雖然有所降低，但低于Ca2+的礦化量，原因是Mg2+水合脫水所需要的能量遠(yuǎn)高于Ca2+所需要的能量[19]。(3)對(duì)照組、蒙脫土組、聚球藻組、聚球藻+蒙脫土組的鎂鈣比依次為0.982 6、0.987 1、1.844 8、1.720 7，表明，蒙脫土的加入會(huì)略微升高培養(yǎng)液的鎂鈣比，而聚球藻的加入會(huì)顯著升高培養(yǎng)液的鎂鈣比，且聚球藻組的鎂鈣比要高于聚球藻+蒙脫土組，充分說明，聚球藻的存在能夠顯著改變培養(yǎng)液中的鎂鈣比，進(jìn)而創(chuàng)造一個(gè)相對(duì)較高的鎂鈣比環(huán)境。

2.4 碳酸鹽礦物組成分析

當(dāng)蒙脫土加量為50 mg·L-1時(shí)，聚球藻組、聚球藻+蒙脫土組培養(yǎng)液沉淀物的XRD圖譜如圖4所示。

圖4 沉淀物的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of sediments

由圖4可以看出，聚球藻組、聚球藻+蒙脫土組的培養(yǎng)液沉淀物碳酸鹽礦物組成相同，主要為文石和低鎂方解石，其中低鎂方解石的最強(qiáng)衍射峰出現(xiàn)在29.5°，對(duì)應(yīng)(104)晶面，其峰高分別為202 950和13 517，表明蒙脫土的加入，使得低鎂方解石的主衍射峰強(qiáng)度明顯降低，礦物的結(jié)晶度明顯降低；文石的衍射峰出現(xiàn)在27.2°、33.1°、36.1°、41.2°、42.9°、45.8°處，分別對(duì)應(yīng)(102)、(201)、(210)、(121)、(212)、(122)晶面，且加入蒙脫土后，文石的衍射峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明蒙脫土作用下，礦物的結(jié)晶度升高。

2.5 碳酸鹽礦物形貌分析

當(dāng)蒙脫土加量為50 mg·L-1時(shí)，聚球藻組、聚球藻+蒙脫土組培養(yǎng)液沉淀物中碳酸鹽礦物的SEM照片如圖5所示。

a.聚球藻組 b.聚球藻+蒙脫土組

由圖5a可以看出，未加蒙脫土?xí)r，聚球藻組碳酸鹽礦物為棒狀和四葉草狀，粒徑為15～60 μm，能譜顯示為低鎂方解石，其間可見藻細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化降解后殘留的?？?，表明藻細(xì)胞呈聚集狀態(tài)，碳酸鹽礦物在細(xì)胞周圍析出；隨著碳酸鹽礦物的生長(zhǎng)，藻細(xì)胞被包埋在碳酸鹽礦物內(nèi)部，這可能是引起葉綠素a含量和碳酸酐酶活性降低的原因。由圖5b可以看出，加入蒙脫土后，聚球藻+蒙脫土組除了棒狀低鎂方解石外，還存在簇狀碳酸鹽礦物，能譜顯示該簇狀碳酸鹽礦物不含鎂元素，結(jié)合形貌判定為文石，粒徑為5～15 μm。表明，未加蒙脫土?xí)r，聚球藻誘導(dǎo)的碳酸鹽礦物主要為棒狀低鎂方解石；加入蒙脫土后，碳酸鹽礦物除棒狀低鎂方解石外，還存在大量簇狀文石，該結(jié)果與XRD分析結(jié)果相符。

鎂元素的含量能夠影響碳酸鹽礦物的形貌和類型，因此，鎂鈣比被認(rèn)為是碳酸鹽礦物形成的關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)因素[20]。研究發(fā)現(xiàn)，方解石通常形成于較低鎂鈣比的環(huán)境中，而文石通常形成于較高鎂鈣比的環(huán)境中[21]，其原因是較高濃度的Mg2+在方解石表面的吸附能夠破壞方解石的晶體結(jié)構(gòu)，但對(duì)文石的形成沒有影響[22]。有研究表明，鎂鈣比為2時(shí)能夠產(chǎn)生方解石和文石，鎂鈣比為4～6時(shí)僅產(chǎn)生文石[6]。本實(shí)驗(yàn)中，未加蒙脫土?xí)r的文石量較少，表明未達(dá)到形成文石所要求的鎂鈣比；而加入蒙脫土后，由于蒙脫土對(duì)聚球藻的聚集作用，使得藻細(xì)胞聚集體中羧基數(shù)量增加、密度升高，而羧基對(duì)Ca2+具有較高的親和力，能夠吸附更多的Ca2+，從而使得藻細(xì)胞聚集體微環(huán)境水體中鎂鈣比升高。所以推測(cè)蒙脫土的加入使藻細(xì)胞聚集體周圍微環(huán)境的鎂鈣比較高，有利于文石的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

在蒙脫土作用下利用聚球藻誘導(dǎo)碳酸鹽礦化，發(fā)現(xiàn)聚球藻能夠誘導(dǎo)碳酸鹽礦化產(chǎn)生低鎂方解石和文石，且以棒狀低鎂方解石為主，粒徑為15～60 μm，其間可見藻細(xì)胞氧化降解后殘留的?？住Ｃ擅撏聊軌虼龠M(jìn)聚球藻細(xì)胞聚集，增加了藻細(xì)胞聚集體中的羧基數(shù)量，使得藻細(xì)胞聚集體周圍微環(huán)境的鎂鈣比升高，抑制了方解石晶核的生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量簇狀文石，粒徑為5～15 μm。