黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物殺松材線蟲活性研究

錢雨可，于金英，汪 冶

（1.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018）

松樹萎蔫?。╬ine wilt disease，PWD）是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner and Buhrer）Nickle（Nickle，1970），pine wilt nematode，PWN）引起的松樹病害，松樹感染松材線蟲（B.xylophilus）之后，發(fā)病初期癥狀表現(xiàn)為松針的黃化和萎蔫[1]。1982年我國在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病[2]，松材線蟲與美國白蛾、松圓蚧一同列為森林三大病源性害蟲，屬國際重要檢疫對象，其中松材線蟲被林業(yè)部列為森林害蟲之首。因此，尋找能夠高效殺滅松材線蟲的生物防治措施，保護松屬植物任務(wù)迫在眉睫。

Metcalf[3]研究發(fā)現(xiàn)：不僅曲霉屬真菌對線蟲具有毒殺作用，而且在工業(yè)領(lǐng)域中，黑曲霉（Aspergillus niger）及其次生代謝產(chǎn)物（如小分子有機酸、雜環(huán)化合物等[4]）在抗線蟲領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用。

筆者利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物，采用室內(nèi)浸漬法測定其次生代謝產(chǎn)物對松材線蟲的毒殺作用，旨在為殺松材線蟲新型生物農(nóng)藥制劑的研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

黑曲霉（A.niger），保存地：麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院天然藥物化學(xué)分析實驗室。

1.1.2 供試線蟲

采用貝爾曼（Baermann）漏斗法從馬尾松疫木中分離松材線蟲，并經(jīng)浙江省林業(yè)科學(xué)研究院鑒定為B.xylophilus。對松材線蟲進行同期化處理[5]，線蟲卵經(jīng)離心分離，接入長滿灰葡萄孢菌的培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后得到處于L4期線蟲，用以毒力測定試驗。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），121℃滅菌20 min。

1.1.4 主要試劑

DMSO（AR）、乙酸乙酯（AR）、M9緩沖液、線蟲裂解液。

1.1.5 實驗設(shè)備

TG16G離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）、KS 4000i control恒溫搖床（IKA）、R-210旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（BUCHI）、旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）、生化培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）、SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

用接種環(huán)挑取保存于試管斜面的黑曲霉劃線接種于PDA培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，待菌落長滿整個平板。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

用滅菌刀切一小塊（1 cm×1 cm）長有黑曲霉菌落的培養(yǎng)基置于PDB中，180 r·min-1、28℃條件下培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液用四層紗布過濾，取150 mL待用。剩余發(fā)酵液加入等體積乙酸乙酯萃取，上層有機相經(jīng)減壓濃縮得到發(fā)酵產(chǎn)物，用1%DMSO溶解有機相溶質(zhì)制成母液。發(fā)酵液與母液用針筒過濾器（孔徑0.22 μm）過濾除菌，置4℃冰箱備用。

1.2.3 試驗分組及毒力試驗

樣品組：將黑曲霉發(fā)酵液用無菌水稀釋0、2、4、8、16倍，各取500 μL于24孔板中。母液用1%DMSO稀 釋 至 濃 度 為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1，各取500 μL于24孔板中。

對照組：取500 μL 1%DMSO于24孔板中。

采用浸漬法[6]測定各菌株發(fā)酵產(chǎn)物對松材線蟲的毒殺作用。樣品組和對照組分別加入500 μL濃度為100條·mL-1的松材線蟲，于28℃條件下放置12、24、36、48 h，觀察線蟲的存活和死亡數(shù)量，并計算死亡率與校正死亡率[7-8]，每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行整理，運用GraphPad Prism8軟件進行數(shù)據(jù)處理與單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)1.2.2節(jié)制備發(fā)酵產(chǎn)物和1.2.3節(jié)毒力實驗測定，發(fā)現(xiàn)黑曲霉的殺松材線蟲活性顯著，其發(fā)酵液稀釋16倍后，經(jīng)12 h處理后的線蟲平均死亡率達89.04%，48 h后線蟲平均死亡率仍可達99.24%（表1）。其胞外代謝產(chǎn)物經(jīng)24 h和48 h處理后的LC50值 分 別 為0.075 5 mg·mL-1和0.071 2 mg·mL-1，在1 mg·mL-1處理24 h后殺蟲效果即可達100%（圖1）。通過GraphPad Prism8軟件對數(shù)據(jù)進行擬合得到黑曲霉代謝產(chǎn)物對松材線蟲的半致死濃度及毒力回歸方程，結(jié)果見表2。

表1 黑曲霉發(fā)酵液殺松材線蟲毒力測定

圖1 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物抗松材線蟲活性

表2 黑曲霉次生代謝產(chǎn)物對松材線蟲的致死濃度效應(yīng)

3 討論

在眾多植物寄生線蟲生防菌中，曲霉屬真菌代謝產(chǎn)生的毒素對線蟲具有防治作用，其中黑曲霉作為實驗與工業(yè)上廉價易得的曲霉屬真菌廣泛應(yīng)用于食品、制藥等領(lǐng)域。其對植物寄生線蟲的致死作用已有文獻報道，如豐波[9]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的作用為2 h致死率達94%，線蟲卵孵化抑制率達86%，且其活性物質(zhì)為非蛋白質(zhì)、不揮發(fā)性成分，易溶于有機溶劑。朱曉峰等[4]通過分析黑曲霉發(fā)酵液中的有機酸成分，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中除草酸外還有其他小分子化合物對甘薯莖線蟲和南方根結(jié)線蟲有活性。李頌等[10]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉代謝產(chǎn)物參與了番茄體內(nèi)與防御反應(yīng)相關(guān)的代謝過程，增強了番茄植株對根結(jié)線蟲病的防效。

通過黑曲霉發(fā)酵得到其次生代謝產(chǎn)物，并對其發(fā)酵液與萃取有機相進行室內(nèi)毒力測定，首次發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對松材線蟲具有顯著殺蟲活性。松材線蟲經(jīng)黑曲霉發(fā)酵液給藥12 h后致死率達100%，經(jīng)發(fā)酵液16倍稀釋給藥12 h后致死率仍可達89.04%，與上述參考文獻中涉及的抗蟲活性無顯著差異，試驗結(jié)果具有一定的可信度。此外，發(fā)現(xiàn)黑曲霉的活性成分存在于發(fā)酵液萃取有機相中（萃余相經(jīng)測定無明顯活性），24 h的LC50值為0.075 5 mg·mL-1，殺蟲活性優(yōu)于目前治療松材線蟲病藥劑阿維菌素（IC500.134 6 mg·mL-1）[11]。

筆者對黑曲霉發(fā)酵液毒殺松材線蟲的作用進行了初步研究，今后還需要對其發(fā)酵液有機相進一步分離純化發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物，并對殺蟲活性成分的毒殺松材線蟲的作用機制方面進行深入研究。