響應(yīng)面法優(yōu)化海金沙多糖提取工藝及其抗氧化活性

陳小燕，梁艷梅，陳旭波

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

海金沙（Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.）隸屬于海金沙科海金沙屬，別名鐵線藤、左轉(zhuǎn)藤。據(jù)《中國畬藥植物圖鑒·上卷》記載，該種植物在南方地區(qū)分布廣泛，主要用于治療尿路結(jié)石、肝腸炎、濕疹等，為地方標(biāo)準(zhǔn)收錄的畬藥。目前，海金沙主要應(yīng)用于中藥處方中，對其單味藥效成分的研究也主要集中在黃酮、酚酸類和甾體苷類等化學(xué)成分方面[1-5]。據(jù)報道，海金沙主要成分具有抗菌消炎[6]、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血糖[7]、抗氧化[8]、消除自由基[9]及其他的臨床治療功效[10]。然而，目前對海金沙有效成分之一的多糖的研究卻相對較少[11]。

植物多糖提取的常見方法有熱水浸提法[12]、復(fù)合酶解法[13]、微波法[14]和超聲波法[15]等。微波提取技術(shù)與傳統(tǒng)的提取方法相比較，具有低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)，更加適合快速提取植物多糖[16]。孫萍等[17]運(yùn)用微波技術(shù)提取甘草多糖發(fā)現(xiàn)：通過微波處理提取不僅能夠有效減短試驗(yàn)周期，實(shí)驗(yàn)中溶劑的消耗量也得到減少，而且多糖的提取率也由傳統(tǒng)方法的9.82%提高到13.90%，較傳統(tǒng)方法提高了41.5%。實(shí)驗(yàn)表明，利用微波技術(shù)更有利于提取多糖。響應(yīng)面分析法是目前采用較多的優(yōu)化方法之一，不僅能夠分析單個因素對提取的影響，還能分析各因素之間的交互作用。它將體系的響應(yīng)值作為一個或多個因素的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)顯現(xiàn)各擬合因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，并且通過計算可推斷出一個較為合理的預(yù)測值。

因此，筆者將以海金沙為實(shí)驗(yàn)材料，采取微波傳統(tǒng)提取法和微波輻射預(yù)處理法提取海金沙多糖，利用濃硫酸-苯酚法，計算多糖的提取率。以多糖提取率作為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。參考姚秋萍等[18]的研究測定海金沙多糖粗提物對超氧陰離子自由基的清除率，以評價海金沙多糖的抗氧化能力，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海金沙的采集

海金沙干粉：海金沙植株于2020年采自麗水學(xué)院校園，陰干，打粉，過40目篩，備用。

1.2 儀器與試劑

電子天平（北京塞多利斯天平有限公司，ISO9001）；電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，HHS）；臺式高速離心機(jī)（SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3K15）；G8023DH L-V8型微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）等。

95%乙醇、葡萄糖溶液、5%苯酚、濃硫酸、10 mmol/L鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）等。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方式

采用Design-Expert 11.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合；利用Spss 16.0進(jìn)行方差分析；利用Excel 2010作圖。

1.4 海金沙多糖提取條件的優(yōu)化

微波傳統(tǒng)提取見前人的研究[16]，傳統(tǒng)提取因素包含了微波時間、微波功率、液料比。在80℃熱水浴中提取60 min，抽濾除渣，獲得海金沙多糖提取液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮到一定體積，然后加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜。次日在4 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀物并重復(fù)醇沉一次，即得水提粗多糖。測定多糖提取率，以確定最佳提取工藝。

微波輻射預(yù)處理參考王趙改等[19]的方法，通過控制微波時間、微波功率、液料比和汽化劑用量等因素對樣品進(jìn)行輻射預(yù)處理。在80℃熱水浴中提取60 min，抽濾除渣得海金沙多糖提取液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至一定體積，然后加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜。次日在4 000 r/min條件下進(jìn)行離心5 min，收集沉淀物并重復(fù)醇沉一次，即得水提粗多糖。測定多糖提取率，以確定最佳提取工藝。

1.5 海金沙多糖提取率的測定

采用濃硫酸-苯酚法[20]對海金沙多糖提取率進(jìn)行測定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別依次精確吸取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加入適量蒸餾水定容到1 mL。加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，在冰浴條件下沿試管壁緩慢加入5 mL濃硫酸，充分搖勻后沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對照組，在490 nm波長下測其吸光值。以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，吸光值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

海金沙多糖提取率的測定：將提取的海金沙多糖定容到一定體積，精確吸取1 mL溶液于試管中，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15 min。取出后迅速冷卻至室溫，于490 nm處測其吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖提取率（%），計算公式如下：式中：C為測得的多糖溶液濃度，μg/mL；V為多糖溶液定容體積，mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，mg。

1.6 海金沙多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.6.1 微波傳統(tǒng)提取法

以海金沙干粉為實(shí)驗(yàn)材料，以多糖提取率作為考察指標(biāo)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計。以測得的多糖提取率當(dāng)作響應(yīng)值，進(jìn)行設(shè)計，詳見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面水平編碼

1.6.2 微波輻射預(yù)處理法

以海金沙干粉為實(shí)驗(yàn)材料，以多糖提取率作為考察目標(biāo)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計，以測得的多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平設(shè)計，單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計如表2所示。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)面水平編碼

1.7 海金沙多糖抗氧化活性測定

取不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的海金沙多糖溶液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-Hcl緩沖液（pH=8.2）5.7 mL，在25℃熱水浴條件下保溫10 min，然后加入于25℃預(yù)熱的鄰苯三酚溶液（6 mmol/L）0.1 mL。迅速搖勻，以多糖溶液為空白組在320 nm處測定反應(yīng)1 min時的吸光值（A2），每組分別設(shè)置3份平行。以等量的蒸餾水代替海金沙多糖溶液，將Tris-Hcl緩沖液調(diào)零，在相同波長下獲得1 min時的吸光值（A1），每組分別設(shè)置3份平行。

對照試驗(yàn)選用不同濃度Vc（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）代替多糖溶液，其余操作步驟、試劑及條件不變，測定吸光度，每組設(shè)3份平行。自由基清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照品，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.007 8x-0.023 5，R2=0.996 1，如圖1所示具有較好的相關(guān)性。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 海金沙多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波傳統(tǒng)提取法

由圖2可知，海金沙多糖提取的最適微波功率為280 W，最大值為4.784%；功率在350～420 W范圍內(nèi)時，較強(qiáng)的微波功率可能導(dǎo)致海金沙多糖的有效成分被分解或被破壞，導(dǎo)致最終多糖提取率反而隨著微波功率的逐漸增大而減小。由圖3可知：在微波時間為0～120 s內(nèi)，提取率出現(xiàn)先上升后下降現(xiàn)象，提取率在60 s時為7.619%。由圖4可知：液料比的大小對提取率有著明顯的影響，20（mL/g）時提取率最大，為8.894%，在到達(dá)峰值后隨著液料比的增大多糖提取率并無明顯的變化，而是趨于平緩。

圖2 多糖提取率對微波功率的響應(yīng)

圖3 多糖提取率對微波時間的響應(yīng)

圖4 多糖提取率對液料比的響應(yīng)

2.2.2 微波輻射預(yù)處理提取法

由圖5可知：在280 W時多糖提取率達(dá)到最大，此時提取率為4.601%。由圖6可知：當(dāng)液料比為20（mL/g）時，多糖提取率達(dá)到最高值，為8.24%。由圖7可知：當(dāng)使用微波處理60 s時，海金沙多糖的提取率最高，為10.14%。由圖8可知：汽化劑在0～7.5 mL之間，海金沙多糖提取率隨著用量的增加而逐漸上升，7.5 mL時多糖的提取率最大，為15.642%。

圖5 多糖提取率對微波功率的響應(yīng)

圖6 多糖提取率對液料比的響應(yīng)

圖7 多糖提取率對微波時間的響應(yīng)

圖8 多糖提取率對汽化劑用量的響應(yīng)

2.3 響應(yīng)曲面結(jié)果與分析

2.3.1 微波傳統(tǒng)提取法的多糖提取率二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對表3中17組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析得到如下方程：

對表3中17組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析得到表4。由表4可知：回歸模型差異極其顯著（P＜0.000 1），失擬項差異不顯著（P=0.087 6＞0.05），這說明該回歸方程具有良好的擬合性，試驗(yàn)誤差值較小說明模型的精確度和準(zhǔn)確度很高，重現(xiàn)性很好。一次項C，二次項A2、B2、C2對海金沙多糖提取率均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影響從大到小的順序?yàn)椋阂毫媳龋疚⒉üβ剩疚⒉〞r間。因素之間的相互作用見圖9～11。

圖9 功率與時間的3D響應(yīng)面圖

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

圖10 液料比與功率的3D響應(yīng)面圖

圖11 液料比與時間的3D響應(yīng)面圖

2.3.2 微波傳統(tǒng)提取法的海金沙多糖提取工藝的確定與驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型及軟件分析得出微波傳統(tǒng)提取海金沙多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為微波功率279.658 6W、微波時間57.007 3 s、液料比23.861（mL/g）。考慮可行性及實(shí)驗(yàn)操作的便利性，將最佳工藝參數(shù)修正為微波功率280 W、微波時間57 s、液料比24（mL/g），該條件下多糖提取率的預(yù)測值為7.756%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明：多糖的提取率為7.582±0.156%，實(shí)際值與預(yù)測值沒有顯著性差異。

2.3.3 微波輻射預(yù)處理提取的海金沙多糖提取率二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對表5中29組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析得到如下方程：

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

對29組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析得到表6。由表6可知：回歸模型差異極其顯著（P＜0.000 1），失擬項差異不顯著（P=0.159 0＞0.05），這說明該回歸方程對試驗(yàn)具有良好的擬合性，試驗(yàn)誤差較小為4.46%，說明模型精確度和可信度較高。一次項A和C，二次項AB、AC、BC、BD對海金沙多糖提取率均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影響從大到小的順序?yàn)橐毫媳龋疚⒉üβ剩疚⒉〞r間＞汽化劑用量。因素間的相互作用見圖12～17。

圖12 功率與時間的3D響應(yīng)面圖

表6 回歸模型方差分析

圖14 汽化劑用量與功率的3D響應(yīng)面圖

圖16 液料比與時間的3D響應(yīng)面圖

2.3.4 微波輻射預(yù)處理提取工藝的確定與驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型及軟件分析得出微波輔助預(yù)處理海金沙多糖的最優(yōu)工藝條件為微波功率338.54 W、微波時間71.25 s、液料比28.00（mL/g）、汽化劑用量4.967 mL。考慮實(shí)驗(yàn)的可行性及操作的便利性，將最佳工藝參數(shù)修正為微波功率350 W、微波時間71 s、液料比28（mL/g）、汽化劑用量5 mL。該條件下多糖提取率的預(yù)測值為13.881%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明：多糖的提取率為13.507±0.177%，實(shí)際值與預(yù)測值沒有顯著性差異。

圖13 液料比與功率的3D響應(yīng)面圖

圖15 汽化劑用量與時間的3D響應(yīng)面圖

圖17 液料比與汽化劑用量的3D響應(yīng)面圖

2.4 海金沙粗多糖的抗氧化活性測定

研究表明：通過測定O2-的清除率能反映出物質(zhì)抗氧化性強(qiáng)弱[21]。本實(shí)驗(yàn)以Vc和兩種提取方法提取的海金沙粗多糖為對象，測定不同樣品對O2-的清除作用。實(shí)驗(yàn)表明：多糖的質(zhì)量濃度越高其相應(yīng)抗氧化能力也就越強(qiáng)。如圖18，樣品質(zhì)量濃度在0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，O2-清除率的上升幅度較大；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，O2-清除率上升趨勢逐漸平緩。從總體上來看，在相同質(zhì)量濃度條件下，Vc清除O2-的能力明顯高于海金沙多糖，但兩種方法提取的海金沙多糖在1 mg/mL條件下對O2-清除率均可以達(dá)到60%以上。

圖18 抗氧化活性

3 討論與結(jié)論

植物多糖提取方法一直是研究的熱點(diǎn)。不同來源的植物多糖具有不同的特征與性質(zhì)，因此在對植物多糖進(jìn)行研究時，應(yīng)針對植物材料的特征和性質(zhì)，選用適宜的提取方法[22]，在盡可能提高多糖提取率的基礎(chǔ)上，保證多糖活性。

微波輻射預(yù)處理法是先使用一定量的汽化劑先對干物料進(jìn)行適當(dāng)時間的浸潤，然后再用高頻電磁波波能對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，最后用熱水提取法進(jìn)行多糖萃取的一種預(yù)處理方法，有別于傳統(tǒng)微波提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)微波功率及處理時間超過一定限度時，多糖提取率不會繼續(xù)增加，反而會下降。這可能是因?yàn)槲⒉ǖ倪^度處理，使有效成分遭到破壞。蔡錦源等[23]利用微波輔助預(yù)處理法提取香菇多糖并與熱水浸提法相對比，表明兩種工藝提取多糖的提取率不同，抗氧化活性也不同，微波輔助預(yù)處理法提取香菇多糖不僅提取率更高，抗氧化活性也更強(qiáng)。筆者采用的兩種微波處理方式表明，其多糖抗氧化活性并沒有顯著性差異。

結(jié)果表明：微波輻射預(yù)處理提取的多糖的提取率（13.509%）顯著高于微波傳統(tǒng)提?。?.756%）。對其粗提物進(jìn)行初步純化后測其抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，兩者抗氧化活性雖均低于Vc，但在1 mg/mL濃度時對O2-清除率均可以達(dá)到60%以上，證實(shí)海金沙多糖具有較好的抗氧化性。本研究得到的多糖提取率略高于肖懷秋和李玉珍的研究（提取率為12.85%）[24]，而提取時間僅為其一半，可見微波輻射預(yù)處理的優(yōu)勢。另外本研究的提取率低于武蕓等人的研究（提取率為16.475%）[25]，這與提取次數(shù)及提取時間的不同有關(guān)。

可見，微波輻射預(yù)處理在提取海金沙多糖方面較微波傳統(tǒng)提取具有一定的優(yōu)勢，提取率高且抗氧化活性不會改變。該方法是否適用于其他植物材料有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。