藥食兩用柳葉蠟梅葉不同茶制品質(zhì)量評價

汪雯欣，程科軍，金 葉

（1.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifoliusS.Y.Hu）為蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus Lindley）半常綠灌木，在浙江、江西及安徽等省份均有分布[1-3]。柳葉蠟梅葉作為畬藥“食涼茶”的植物來源收載于《浙江省中藥炮制規(guī)范》[4]。早在北宋年間，畬民就有使用食涼茶治療和預(yù)防感冒的習(xí)慣，距今已有近千年應(yīng)用歷史。食涼茶在畬藥中的使用最為廣泛、影響最大，被譽為“畬藥第一味”[5]。食涼茶具有祛風(fēng)解表、清熱解毒、理氣健脾、消導(dǎo)止瀉等功效，臨床主要用于治療因感受風(fēng)寒引起的肚痛、肚脹、腹瀉，或因飲食不當而引起的消化不良、腹部脹痛等癥。國家衛(wèi)計委于2014年批準了柳葉蠟梅為新食品原料[6]，使其在食品方面的深加工研發(fā)與后續(xù)營銷有了法律許可，更為柳葉蠟梅的規(guī)模化種植、工業(yè)化生產(chǎn)和深加工開發(fā)開辟了廣闊的發(fā)展空間。柳葉蠟梅早年的食用僅為晾干的原植物葉，并未經(jīng)任何復(fù)雜工藝制作，存在外觀松散、質(zhì)脆易斷等缺點。2008年以來，麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院研制開發(fā)了柳葉蠟梅葉的綠茶制品，其采用珠茶加工方式，通過攤放、殺青、揉捻、初烘、復(fù)揉、滾干做形等工序制作而成[7-8]。柳葉蠟梅綠茶（珠茶）外形顆粒圓緊、色澤綠潤、香高持久、經(jīng)久耐泡，沖泡后湯色碧綠明亮。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對柳葉蠟梅的研究主要集中在種屬分類[9]、人工栽種[10-11]、化學(xué)成分[12-18]、生物活性[19-21]、簡單分離提取工藝[22-24]和質(zhì)量標準[25-26]等方面。但上述報道中涉及的材料來源均為原植物葉，未見柳葉蠟梅葉茶制品化學(xué)成分的相關(guān)報道。本研究以規(guī)范化種植基地的柳葉蠟梅綠茶和紅茶制品為研究對象，建立指紋圖譜的同時測定柳葉蠟梅茶制品中蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚的含量，對比分析綠茶和紅茶加工工藝對指標成分的影響，以期為全面評價柳葉蠟梅茶制品的產(chǎn)品質(zhì)量提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（配有DAD檢測器），美國安捷倫科技公司生產(chǎn)。對照品蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%。色譜純甲醇和乙腈購自北京百靈威科技有限公司。其他試劑為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 柳葉蠟梅綠茶和紅茶樣品

柳葉蠟梅綠茶和紅茶由麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院制備，鮮葉來源均為浙江省衢州市開化縣。綠茶（珠茶）制備工藝：4月下旬至5月采摘一芽一葉或者一芽二葉，長度6 cm以內(nèi)的鮮葉，經(jīng)攤放、殺青、揉捻、解塊、干燥等工序制作珠茶，具體加工技術(shù)參見報道[7]。柳葉蠟梅紅茶制作工藝：柳葉蠟梅鮮葉在室內(nèi)萎凋至鮮葉含水率60%左右，輕壓揉捻成條，發(fā)酵4 h（30℃，相對濕度95%），初烘30 min（120℃），足干90 min（90℃）。將10批柳葉蠟梅綠茶和紅茶樣品依次編號為S1～S10，樣品信息見表1。水分含量測定采用2020年版《中國藥典》四部的烘干法。

表1 柳葉蠟梅綠茶和紅茶樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 對照品溶液制備

分別取所需對照品適量，精密稱定，70%甲醇溶解后制成蘆丁0.60 mg/mL、異槲皮苷0.66 mg/mL、山柰酚-3-O-蕓香糖苷2.0 mg/mL、槲皮苷0.55 mg/mL、槲皮素0.59 mg/mL、山柰酚0.52 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

分別取柳葉蠟梅紅茶和柳葉蠟梅綠茶樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，30℃以下超聲處理40 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～25 min，A（5%→15%）；＞25～45 min，A（15%→20%）；＞45～90 min，A（20%→50%）；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35℃；檢測波長360 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 指紋圖譜方法學(xué)

精密度試驗：制備S1供試品溶液，按“2.2”項色譜條件連續(xù)進樣6次，以峰形對稱且響應(yīng)值大的10號峰（山柰酚-3-O-蕓香糖苷）為參照峰，用于計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果表明：指紋圖譜相似度均大于0.99，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.39%，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：制備S1供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24、32、48 h進樣。結(jié)果表明：指紋圖譜相似度均大于0.96，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.51%，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：平行制備6份S1供試品溶液，進樣分析。結(jié)果表明：指紋圖譜相似度均大于0.94，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.54%，方法重復(fù)性良好。

2.3.2 定量分析方法學(xué)

線性和檢出限：精密吸取混合對照品溶液，稀釋至不同濃度，按“2.2”項色譜條件進樣分析。以各對照品進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。將已知質(zhì)量濃度樣品的信號與噪聲信號進行比較，以信噪比為3∶1時的質(zhì)量濃度確定檢出限。

精密度：取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，各指標成分的峰面積RSD值均小于0.27%。重復(fù)性：平行制備6份S5供試品溶液，各指標成分的峰面積RSD值均小于1.88%。穩(wěn)定性：制備S5供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24、32、48 h測定，各指標成分的峰面積RSD值均小于1.78%。

加樣回收率：取S5供試品溶液9份（3份/組，各指標成分含量已知），每組樣品分別精密加入0.5、1.0和1.5倍已知含量的對照品溶液。加樣回收結(jié)果顯示：各指標成分的回收率在96.12%～103.2%之間，RSD值均小于1.97%。定量分析方法學(xué)考察結(jié)果見表2。

表2 液相色譜法方法學(xué)參數(shù)和標準曲線

2.4 指紋圖譜建立和相似度評價

取柳葉蠟梅綠茶和紅茶樣品（S1～S10），分別按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項方法采集指紋圖譜（見圖1）。在“中藥色譜指紋圖譜相似度價系統(tǒng)”（2012版）中采用平均數(shù)法生成柳葉蠟梅綠茶和紅茶的對照指紋圖譜。柳葉蠟梅紅茶樣品的指紋圖譜共標定18個共有峰（占總峰面積90%以上）。根據(jù)對照品比對、加樣回收試驗和參考文獻［27-28］，指認6、8、10、11、15和17號峰分別為蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚。柳葉蠟梅綠茶樣品的指數(shù)圖譜共標定16個共有峰（占總峰面積90%以上），除槲皮素和山柰酚未檢出外，其他共有峰與紅茶一致。柳葉蠟梅紅茶和綠茶的對照指紋圖譜以及混合對照品色譜圖中的色譜峰指認結(jié)果如圖2所示。

圖1 柳葉蠟梅綠茶和紅茶指紋圖譜

圖2 混合對照品色譜圖（A）及柳葉蠟梅紅茶（B）和綠茶（C）的對照指紋圖譜

柳葉蠟梅綠茶和紅茶的指紋圖譜相似度計算結(jié)果表明：柳葉蠟梅紅茶（S5～S10）之間的相似度大于0.984，因此2021年5—10月制備的柳葉蠟梅紅茶樣品質(zhì)量沒有明顯差異。柳葉蠟梅綠茶（S1～S4）的相似度大于0.987。然而不同年份的綠茶樣品中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和指標成分總量等峰面積數(shù)據(jù)存在逐年下降的情況，可見“中藥色譜指紋圖譜相似度價系統(tǒng)”中使用的夾角余弦算法對綠茶樣品之間的色譜數(shù)據(jù)差異不夠敏感。此外，柳葉蠟梅綠茶和紅茶的指紋圖譜相似度均低于0.507，因此柳葉蠟梅綠茶和紅茶雖原料相同，但兩種茶的制作方式不一，使得兩種茶的化學(xué)成分種類和含量有較大區(qū)別。

2.5 指標成分含量測定

柳葉蠟梅綠茶和紅茶樣品中蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚的含量測定結(jié)果見表3。柳葉蠟梅綠茶的黃酮類化合物中，山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量最高（占總峰面積的44%），槲皮素和山柰酚則未檢測出。2018年至2021年制備的柳葉蠟梅綠茶中上述黃酮類成分總量逐年下降。2018年制備的綠茶樣品中黃酮類成分總量僅為2021年綠茶樣品的51%，可見存放年限對綠茶質(zhì)量影響較大。

圖1、圖2和表3結(jié)果顯示：柳葉蠟梅綠茶中未被檢出的槲皮素和山柰酚在柳葉蠟梅紅茶中含量較高。6種指標成分中，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮苷為黃酮醇苷類化合物，而槲皮素和山柰酚則為黃酮醇類化合物。在紅茶制作過程中，黃酮醇苷在熱和酶的作用下發(fā)生水解，脫去糖苷類配基生成黃酮醇，在一定程度上減少了黃酮苷類物質(zhì)的苦味。作為柳葉蠟梅綠茶中含量最高的黃酮醇苷——山柰酚-3-O-蕓香糖苷在紅茶制作過程中發(fā)生水解，脫去蕓香糖，生成山柰酚。因此，在柳葉蠟梅紅茶中，黃酮醇類結(jié)構(gòu)的山柰酚和槲皮素含量最高（占總峰面積的49%），且黃酮類成分總量遠低于柳葉蠟梅綠茶。

表3 柳葉蠟梅綠茶（S1～S4）和柳葉蠟梅紅茶（S5～S10）中6種指標成分含量測定結(jié)果 單位：mg/g

3 討論

柳葉蠟梅是畬族習(xí)用藥材，也是浙西南人民使用廣泛的藥食兩用植物，民間主要使用曬干的原植物葉，其缺點是質(zhì)脆易斷、不易保存，不利于食涼茶的市場推廣。近年來，麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院采用綠茶加工方式將柳葉蠟梅嫩芽葉制作成精制食涼茶，所制綠茶（珠茶）湯色碧綠，具有桉油精的特殊清香，口感清爽、略苦澀。此外，本研究首次制備柳葉蠟梅紅茶，所制紅茶沖泡后湯色紅且明亮，桉油精的特殊氣味基本消失，滋味較醇，苦澀感較綠茶明顯降低。

本研究首次構(gòu)建了柳葉蠟梅不同茶制品的液相指紋圖譜，方法簡單、重復(fù)性好。紅茶和綠茶樣品分別標記出18個和16個共有峰，色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD值均低于1.54%。柳葉蠟梅紅茶中檢測出6種黃酮類成分，包括蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚；綠茶樣品以黃酮醇苷類成分為主，指標成分包括蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮苷，未檢出槲皮素和山柰酚。紅茶和綠茶樣品中，上述指標成分峰面積占共有峰面積的82%和83%，基本能夠代表紅茶和綠茶化合物信息。此外，柳葉蠟梅紅茶和綠茶的指紋圖譜相似度低于0.507，可見不同茶制品由于生產(chǎn)工藝不同，其化學(xué)成分種類存在明顯差異。

2021年不同時間制備的6批紅茶樣品相似度大于0.984，質(zhì)量相對穩(wěn)定。2018—2021年的綠茶樣品隨保存時間增加，指標成分峰面積出現(xiàn)規(guī)律性下降，但不同年份的綠茶樣品相似度仍大于0.987。相似度計算結(jié)果無法體現(xiàn)綠茶質(zhì)量變化的主要原因在于：色譜指紋圖譜相似度計算一般采用夾角余弦法，該算法主要從整體上表達指紋圖譜的平均相似程度，對濃度變化不夠敏感、對圖譜間的細微差異分辨能力不足[29]。因此，指紋圖譜無法完整體現(xiàn)柳葉蠟梅茶制品隨保存時間發(fā)生的質(zhì)量變化，需要結(jié)合指標成分含量測定方法控制其質(zhì)量。后續(xù)的含量測定結(jié)果表明：隨著保存時間增加，綠茶樣品中含量較高的蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量和4種指標成分總量出現(xiàn)規(guī)律下降。尤其是保存一年后的2020年綠茶樣品，黃酮類成分含量較2021年綠茶樣品大幅度下降。柳葉蠟梅紅茶樣品中黃酮類成分總量僅為綠茶樣品的18%～39%；以山柰酚-3-O-蕓香糖苷為代表的黃酮醇苷，在紅茶制作過程中大量水解成山柰酚等黃酮醇類化合物。

目前關(guān)于柳葉蠟梅茶制品的質(zhì)量研究未見報道，而柳葉蠟梅葉作為一種可再生的藥食兩用植物資源，具有很大的藥用和食用潛力，可以進行深入研究。本研究所建立的液相指紋圖譜和含量測定方法不僅可以為柳葉蠟梅茶制品的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也初步確定了柳葉蠟梅茶制品質(zhì)量控制的指標性成分，進而為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。