中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白及自噬相關(guān)蛋白評估老年膿毒癥患者預(yù)后的價值

姜美妮, 梁繼芳, 王秀哲, 趙彩霞, 武衛(wèi)東

(山西白求恩醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 山西 太原, 030032)

膿毒癥是一類常見的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其主要病理過程為在感染、創(chuàng)傷等因素刺激下，患者體內(nèi)炎性因子及趨化因子大量表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體處于過度免疫反應(yīng)狀態(tài)，在清除病原體過程中對自身組織、器官也產(chǎn)生了一定的損傷[1-2]。膿毒癥患者的主要臨床特點(diǎn)為低血壓、低血氧、代謝性酸中毒和多器官功能衰竭。流行病學(xué)資料[3-4]顯示，每年約有1 800萬新發(fā)膿毒癥患者，好發(fā)于老年人，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，膿毒癥患者死亡率高達(dá)30%～70%, 是重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡的主要病因之一。目前，微生物培養(yǎng)是膿毒癥診治的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方式存在耗時較長、準(zhǔn)確率不高等缺點(diǎn)[5]。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是一類分泌型糖蛋白，既往研究[6]將NGAL作為診斷急性腎損傷的生物標(biāo)志物。研究[7]證實(shí)，在急性腎損傷合并膿毒癥患者中, NGAL呈異常表達(dá)。自噬是真核生物存在的一種自穩(wěn)機(jī)制，研究[8]表明免疫反應(yīng)可調(diào)節(jié)自噬，而自噬也對免疫反應(yīng)產(chǎn)生一定的影響。近年來研究[9]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者的器官損傷與自噬存在一定聯(lián)系，自噬相關(guān)蛋白可導(dǎo)致細(xì)胞自噬障礙，進(jìn)而加速細(xì)胞的凋亡和壞死，促進(jìn)膿毒癥的發(fā)展。本研究探討NGAL及自噬相關(guān)蛋白Beclin、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ(LC3-Ⅱ)對老年膿毒癥患者預(yù)后評估的價值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2021年1月本院收治的97例老年膿毒癥患者為膿毒癥組，另選取同期97例體檢健康人群為對照組。膿毒癥組納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合《膿毒癥與感染性休克的國際共識(第3版)》[10]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者; ② 重癥監(jiān)護(hù)室住院時間≥48 h者; ③ 入院時急性生理與慢性健康(APACHE II)評分>12分者; ④ 臨床資料完整者; ⑤ 年齡≥60周歲者; ⑥ 患者及其家屬知情且同意。對照組納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡≥60周歲者; ② 近3個月內(nèi)體檢健康者; ③ 研究對象及其家屬知情且同意。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 入院時接受抗感染治療的膿毒癥患者; ② 合并免疫缺陷疾病者; ③ 合并其他感染性疾病者; ④ 依從性差者。膿毒癥組中男56例，女41例，年齡(69.30±4.30)歲; 原發(fā)疾病為外傷52例，手術(shù)27例，其他18例; APACHE Ⅱ評分為(17.49±2.24)分，序貫器官衰竭評估量表(SOFA)評分為(6.87±1.35)分。對照組中男52例，女45例，年齡(69.80±5.10)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有研究對象在入組時抽取靜脈血2管，每管5 mL(膿毒癥組在未接受治療前抽取)，其中一管以3 500轉(zhuǎn)/min離心10 min, 離心半徑8 cm, 分離血清，采用免疫比濁法(AU400全自動生化分析儀, Olympus公司，日本)檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Spectra-MaxParadigm多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司)檢測降鈣素原(PCT)、NGAL水平，試劑均購自上海碧云天生物科技有限公司; 另一管采用RNA提取試劑盒提取外周全血RNA, 并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)SYBR RT-PCR試劑盒(中國杭州博日科技有限公司)說明書進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 循環(huán)35次。采用2-△△Ct法測定各組BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA相對表達(dá)量，內(nèi)參為GADPH, 每個樣本重復(fù)3次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)引物序列

膿毒癥組在入院時評估APACHE Ⅱ評分及SOFA評分，并根據(jù)APACHE Ⅱ評分將膿毒癥組分為輕度組(n=44)、中度組(n=28)和重度組(n=25)。APACHE Ⅱ評分[11]包括急性生理評分、年齡評分以及慢性健康評分3個方面，分值越高提示患者預(yù)后越差。SOFA評分[12]主要內(nèi)容是對患者以連續(xù)形式進(jìn)行單個器官功能評價，分值越高提示患者預(yù)后越差。隨訪28 d, 根據(jù)膿毒癥患者存活情況分為存活組(n=71)和死亡組(n=26)。

1.3 觀察指標(biāo)

主要指標(biāo): ① 比較膿毒癥組與對照組BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平; ②采用Pearson相關(guān)法分析膿毒癥患者BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分及SOFA評分的相關(guān)性; ③ 比較存活組與死亡組BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平; ④ 采用受試者工作特征(ROC)曲線分析BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平評估患者預(yù)后的臨床價值。

次要指標(biāo): ① 比較膿毒癥組與對照組血清CRP、PCT水平; ② 比較膿毒癥組輕度、中度、重度患者各項(xiàng)指標(biāo)水平; ③ 比較存活組與死亡組CRP、PCT水平; ④ 采用ROC曲線分析CRP、PCT評估患者預(yù)后的臨床價值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膿毒癥組與對照組Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL、CRP、PCT水平比較

相較于對照組，膿毒癥組NGAL、CRP、PCT水平升高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 膿毒癥組與對照組Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL、CRP、PCT水平比較

2.2 不同病情程度膿毒癥患者各項(xiàng)指標(biāo)水平比較

隨著膿毒癥病情逐漸加重，輕度組、中度組、重度組患者NGAL、CRP、PCT水平逐步越高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平逐步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 不同病情程度膿毒癥患者各項(xiàng)指標(biāo)水平比較

2.3 膿毒癥患者Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分及SOFA評分的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示, CRP、PCT、APACHE Ⅱ評分及SOFA評分與NGAL水平均呈正相關(guān)，與BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 膿毒癥患者Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 存活組與死亡組各項(xiàng)指標(biāo)水平比較

膿毒癥患者中，相較于存活組，死亡組NGAL、CRP、PCT水平更高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 存活組與死亡組各項(xiàng)指標(biāo)水平比較

2.5 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平評估患者預(yù)后的臨床價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)CRP截?cái)嘀禐?1.81 mg/L時，其評估患者預(yù)后的曲線下面積(AUC)為0.62; 當(dāng)PCT截?cái)嘀禐?.54 ng/mL時，其評估患者預(yù)后的AUC為0.73; 當(dāng)NGAL截?cái)嘀禐?53.46 ng/mL時，其評估患者預(yù)后的AUC為0.90; 當(dāng)Beclin mRNA截?cái)嘀禐?.81時，其評估患者預(yù)后的AUC為0.89; 當(dāng)LC3-ⅡmRNA截?cái)嘀禐?.87時，其評估患者預(yù)后的AUC為0.87。BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL聯(lián)合評估患者預(yù)后的AUC為0.95。見表6、圖1。

圖1 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平評估患者預(yù)后的ROC曲線

表6 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平評估患者預(yù)后的臨床價值

3 討 論

膿毒癥患者體內(nèi)會釋放大量炎性因子，炎性因子可以促進(jìn)機(jī)體抵御病原體的侵襲，當(dāng)其過度表達(dá)時又會打破免疫反應(yīng)的平衡，導(dǎo)致免疫功能紊亂。目前，臨床上采用部分炎性因子作為評估病情的輔助指標(biāo)。PCT、CRP是臨床上評估炎性反應(yīng)疾病的常用指標(biāo)。正常生理?xiàng)l件下, PCT、CRP水平較低，當(dāng)發(fā)生感染時, PCT、CRP水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示，相較于正常人群，膿毒癥患者PCT、CRP水平均有所升高。既往研究[13]表明, PCT水平升高主要由細(xì)菌性感染或細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素和炎性因子所致，而機(jī)體發(fā)生病毒性感染或在其他因素刺激下往往并不會引起PCT水平的上升，而膿毒癥往往也受病毒感染的影響。此外, CRP水平在自身免疫性疾病、燒傷等情況下也有所上升，具有特異性較差的缺點(diǎn)[14]。因此，將PCT或CRP作為膿毒癥的生物標(biāo)志物往往存在一定的缺點(diǎn)，難以獲得較好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于存活組，死亡組PCT及CRP水平均有所上升，但CRP及PCT水平評估患者預(yù)后的AUC均小于0.8, 且靈敏度及特異度不高，這也進(jìn)一步說明CRP及PCT作為膿毒癥的生物學(xué)標(biāo)志物的不足。

NGAL是一種分泌蛋白，在機(jī)體炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程中起著重要作用。研究[15]表明, NGAL主要在炎性損傷的中性粒細(xì)胞或其他細(xì)胞中表達(dá); 正常生理?xiàng)l件下，人體外周血NGAL表達(dá)極低，當(dāng)機(jī)體處于炎性反應(yīng)狀態(tài)時，體內(nèi)的促炎及抗炎系統(tǒng)會促使中性粒細(xì)胞被炎性因子激活，進(jìn)而釋放大量的NGAL。研究[16]發(fā)現(xiàn), NGAL在膿毒癥的診斷、病情評估及預(yù)后評估中也扮演著重要角色。國外一項(xiàng)前瞻性研究[17]發(fā)現(xiàn)，血漿NGAL對膿毒癥急性腎損傷的診斷具有較高的臨床價值。本研究結(jié)果顯示，相較于健康人群，膿毒癥患者外周血NGAL水平顯著上升; 隨著患者病情嚴(yán)重程度的增加，其外周血NGAL水平也有所上升，且NGAL水平與CRP、PCT及APACHE Ⅱ評分、SOFA評分均呈正相關(guān)，這也提示膿毒癥患者NGAL水平顯著上升，并與患者病情程度及炎性反應(yīng)程度密切相關(guān)。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，細(xì)胞通過自噬回收細(xì)胞質(zhì)，并對缺陷或過量的細(xì)胞器進(jìn)行降解，從而維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。自噬參與炎性反應(yīng)過程，并在疾病的診斷及病情評估中具有一定的臨床價值[18]。研究[19]表明，機(jī)體發(fā)生感染性損傷后，自噬將出現(xiàn)短暫性升高，隨后其表達(dá)及活性水平將受到抑制。既往研究[20]證實(shí)，膿毒癥肝衰竭的標(biāo)志性事件之一為自噬水平的下降，因此臨床上將自噬作為評估炎癥性疾病治療效果的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，相較于正常人群，膿毒癥患者自噬相關(guān)基因的表達(dá)顯著下降，自噬相關(guān)基因的表達(dá)與患者病情程度及炎性反應(yīng)程度均呈負(fù)相關(guān)，提示膿毒癥患者體內(nèi)自噬處于抑制的狀態(tài)，并與患者病情程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL評估患者預(yù)后的AUC均超過0.8, 而3個指標(biāo)聯(lián)合評估的AUC超過0.9, 靈敏度及特異度也較高，提示BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL聯(lián)合評估膿毒癥患者預(yù)后具有較高的臨床價值。本研究的不足為: ① 未動態(tài)觀察各指標(biāo)變化情況，難以獲得連續(xù)性資料; ② 研究所納入樣本量較小，且樣本來源為單中心。因此，后續(xù)仍需開展多中心、大樣本研究以進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。

綜上所述，膿毒癥患者NGAL水平顯著升高，而BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平顯著下降，并與患者病情嚴(yán)重程度及炎性反應(yīng)密切相關(guān), NGAL、BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平在評估患者預(yù)后中均具有一定的臨床價值。