趨化因子配體13在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

劉銀鳳, 袁關(guān)利, 劉佳妮, 韓 猛, 呂 驥, 吳梓政

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院, 1.乳腺外科, 2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 河北 秦皇島, 066000)

2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù)據(jù)[1]顯示，乳腺癌已取代肺癌成為全球發(fā)病率第一的癌癥，估計(jì)2020年新發(fā)乳腺癌病例230萬，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均呈陰性表達(dá)的乳腺癌，通常表現(xiàn)出較高的侵襲性特征，包括較早的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。由于缺少特異性的治療靶點(diǎn)，很長一段時間內(nèi)化學(xué)療法是作為TNBC唯一的全身治療手段，但其臨床效果并不理想，轉(zhuǎn)移性TNBC患者的中位總生存期(OS)僅為12～18個月[2-3]。免疫檢查點(diǎn)程序性死亡受體1(PD-1)在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)增加，可幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，與腫瘤患者預(yù)后不良呈正相關(guān)[4]。阻斷PD-1、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)的免疫治療已應(yīng)用于TNBC的臨床治療，可部分改善患者的預(yù)后，但TNBC 仍是乳腺癌中預(yù)后最差的亞型[5]。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的主要場景，趨化因子與趨化因子受體之間相互作用將不同的免疫細(xì)胞亞群募集到腫瘤微環(huán)境中，影響腫瘤的進(jìn)展和治療[6]。趨化因子是一類由細(xì)胞分泌的信號蛋白或細(xì)胞因子超家族，根據(jù)氨基端半胱氨酸的排列方式可分為CXC、CC、CX3C和XC共4個大類，趨化因子與趨化因子受體相互作用，誘導(dǎo)特定細(xì)胞的定向遷移，在細(xì)胞生長、分化、活化和免疫應(yīng)答中起重要作用[7]。趨化因子配體13(CXCL13)也稱B細(xì)胞趨化因子-1, 是CXC趨化因子家族成員之一，其特異性受體為CXC亞家族趨化因子受體5(CXCR5)。CXCL13和CXCR5信號通路與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能密切相關(guān)，尤其在腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)的浸潤過程中起著至關(guān)重要的作用[8]。CXCR5表達(dá)于成熟的B細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和濾泡樹突細(xì)胞, CXCL13選擇性地與CXCR5結(jié)合并控制CXCR5陽性細(xì)胞向次級淋巴器官的遷移。因此, CXCL13和CXCR5的相互作用控制著B細(xì)胞在形成淋巴濾泡中的定位和結(jié)構(gòu)組織[9]。雖然臨床應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的目標(biāo)是恢復(fù)耗竭的T淋巴細(xì)胞功能，但B細(xì)胞也是決定治療效果的主要因素，推測CXCL13可能在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療中發(fā)揮重要的作用。一項(xiàng)薈萃分析研究[10]也表明, CXCL13是晚期腫瘤患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感性的預(yù)測指標(biāo)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)挖掘CXCL13 在TNBC中的生物學(xué)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

下載癌癥基因組圖譜(TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)中132例病理類型為浸潤性癌的TNBC組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和患者的臨床資料，所有樣本均包含完整的高通量測序counts 數(shù)據(jù)及患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期、生存狀態(tài)和總生存時間，排除臨床分期不明和預(yù)后信息不詳?shù)幕颊摺?/p>

1.2 CXCL13在癌組織中的差異性表達(dá)的分析

登錄腫瘤免疫評估資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫(https://cist rome.shinyapps.io/timer), 進(jìn)入DiffExp module, Gene Symbol搜索欄輸入CXCL13, 分析CXCL13在不同腫瘤組織和對應(yīng)的正常組織中的表達(dá)差異。采用 Wilcoxon test對TCGA 數(shù)據(jù)庫中132例TNBC組織與113例對應(yīng)正常乳腺組織中CXCL13mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.3 CXCL13表達(dá)水平與TNBC患者臨床病理參數(shù)及OS的相關(guān)性分析

根據(jù)CXCL13表達(dá)量的中位數(shù)，將TCGA數(shù)據(jù)庫中132個TNBC樣本分為CXCL13高表達(dá)組66例和CXCL13低表達(dá)組66例，采用卡方檢驗(yàn)分析2組年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM 分期的差異，采用Kaplan-Meier法分析并繪制2組OS曲線。應(yīng)用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫挖掘CXCL13表達(dá)量對TNBC患者OS的影響，再次驗(yàn)證CXCL13表達(dá)水平與TNBC患者OS的相關(guān)性。

1.4 功能富集分析(GSEA)

從GSEA網(wǎng)站(DOI: 10.107 3/pnas.0506580102, http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)獲得了GSEA軟件(version 3.0), 根據(jù)CXCL13的表達(dá)水平將TNBC樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并從Molecular Signatures Database(DOI: 10.109 3/bioinformatics/btr260, http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp)下載了c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt子集合，用于評估相關(guān)途徑和分子機(jī)制，基于基因表達(dá)譜和表型分組，設(shè)定最小基因集為5, 最大基因集為5 000, 1 000次重抽樣,P<0.05、FDR<0.25為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 CXCL13與TNBC中TIL浸潤情況及常見免疫檢查點(diǎn)表達(dá)量的相關(guān)性分析

使用TIMER數(shù)據(jù)庫，首先進(jìn)入Gene module, Gene Symbol搜索欄輸入CXCL13, Cancer Types選擇BRCA-basal, 計(jì)算出CXCL13表達(dá)量對B細(xì)胞、T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞浸潤情況的影響。進(jìn)入Correlation module, Cancer Type選擇BRCA-basal, Correlation Adjusted by選擇None, Gene Symbols(X-axis)輸入CXCL13, Gene Symbols(Y-axis)分別輸入PD-1、PD-L1和CTLA4, 分析CXCL13表達(dá)量與常見免疫檢查點(diǎn)PD-1、PD-L1及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA4)表達(dá)量的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 CXCL13在TNBC組織中的差異性表達(dá)

TIMER數(shù)據(jù)庫DiffExp module分析顯示, CXCL13在乳腺癌(BRCA)、食管癌(ESCA)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等腫瘤組織中和皮膚黑色素瘤的轉(zhuǎn)移病灶中呈高表達(dá)，而在結(jié)腸癌(COAD)、肝細(xì)胞癌(LIHC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、甲狀腺癌(THCA)中呈低表達(dá)，并且在各分子分型的乳腺癌中，TNBC中CXCL13表達(dá)量高于其他亞型乳腺癌。TCGA數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果也顯示，與對應(yīng)正常乳腺組織相比, TNBC組織中CXCL13表達(dá)量升高(P<0.001)。見圖1。

A: TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; B: TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果。

2.2 CXCL13表達(dá)量與TNBC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明, CXCL13表達(dá)量與TNBC患者年齡、腫瘤大小無相關(guān)性，但CXCL13高表達(dá)的TNBC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率更低，腫瘤分期為I期的患者比率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見表1。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示, CXCL13高表達(dá)的TNBC患者的OS高于CXCL13低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果顯示, CXCL13高表達(dá)的TNBC患者OS高于CXCL13低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A: TCGA數(shù)據(jù)庫分析的OS結(jié)果; B: Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析的OS結(jié)果。

表1 TNBC患者CXCL13表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

2.3 CXCL13表達(dá)在TNBC中的生物學(xué)功能分析

GSEA結(jié)果顯示, CXCL13表達(dá)主要與B細(xì)胞受體通路、T細(xì)胞受體通路、抗原加工與提呈通路、細(xì)胞因子及其受體相互作用通路顯著相關(guān), CXCL13高表達(dá)時上述通路相關(guān)基因顯著富集。見圖3。

A: B細(xì)胞受體通路; B: T細(xì)胞受體通路; C: 抗原加工與提呈通路; D: 細(xì)胞因子及其受體相互作用通路。

2.4 CXCL13表達(dá)與TNBC 中TIL浸潤及常見免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的相關(guān)性分析

TIMER數(shù)據(jù)庫Gene module分析結(jié)果顯示, CXCL13表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤水平無相關(guān)性(r=-0.093,P>0.05), 與腫瘤純度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.640,P<0.001), 與B細(xì)胞(r=0.643,P<0.001)、CD8+T細(xì)胞(r=0.454,P<0.001)、CD4+T細(xì)胞(r=0.454,P<0.001)、中性粒細(xì)胞(r=0.463,P<0.001)、樹突狀細(xì)胞(r=0.528,P<0.001)的浸潤水平呈顯著正相關(guān)。TIMER數(shù)據(jù)庫Correlation module分析結(jié)果顯示, CXCL13表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)PD-1(PDCD1)(r=0.885,P<0.001)、PD-L1(CD274)(r=0.722,P<0.001)、CTLA4(r=0.847,P<0.001)的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。見圖4。

A: CXCL13表達(dá)與TIL浸潤的關(guān)系; B: CXCL13表達(dá)與常見免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的關(guān)系。

3 討 論

TNBC是乳腺癌中預(yù)后最差的一種亞型，發(fā)病率占乳腺癌的15%～20%, 具有分化不良、侵襲性高、生存期短、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。目前, TNBC的臨床治療效果仍不理想，患者的預(yù)后仍未得到顯著改善[11]。TIMER數(shù)據(jù)庫DiffExp module分析顯示, CXCL13在乳腺癌中高表達(dá)，尤其在TNBC中表達(dá)最高; 對TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘也提示CXCL13在 TNBC中高表達(dá)，并且CXCL13 高表達(dá)與TNBC患者OS的延長顯著相關(guān)，這提示CXCL13是TNBC預(yù)后的預(yù)測因子。

免疫治療是指通過喚醒機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞的抗腫瘤作用，從而消滅腫瘤細(xì)胞[12]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑是目前腫瘤免疫治療的主要手段，主要免疫檢查點(diǎn)包括PD-1、PD-L1和CTLA-4[13]。免疫治療可延長其他實(shí)體腫瘤的生存期，是治療TNBC很有前途的一種治療策略。既往研究[12]表明, PD-L1在TNBC組織中的表達(dá)水平高于非腫瘤組織，免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)升高以及腫瘤微環(huán)境中TIL浸潤豐富可改善TNBC患者的預(yù)后，這些結(jié)果也提示免疫檢查點(diǎn)阻斷在TNBC的治療中存在巨大潛力?；谧钚鹿嫉碾S機(jī)Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果[14], 在化療基礎(chǔ)上加用PD-1單抗治療可部分改善晚期TNBC患者的預(yù)后，《中國臨床腫瘤學(xué)會乳腺診療指南(2021版)》和《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診療指南與規(guī)范(2021版)》均推薦PD-1抑制劑可聯(lián)合化療應(yīng)用于早期TNBC的新輔助治療或晚期TNBC的解救治療，這拉開了TNBC臨床免疫治療的序幕。多種因素均可影響 PD-1單抗的藥物療效，包括腫瘤負(fù)荷、PD-L1表達(dá)水平、抗原提呈缺陷以及腫瘤微環(huán)境中TIL的富集程度、位置、活化程度、免疫效應(yīng)細(xì)胞與免疫抑制細(xì)胞的比例等[15-19]。PD-1/PD-L1單抗治療并非對所有的TNBC患者有效，如何篩選免疫治療的適用人群、增強(qiáng)免疫治療的療效是現(xiàn)階段TBNC免疫治療的難點(diǎn)。因此，篩選出能夠準(zhǔn)確預(yù)測免疫治療反應(yīng)的分子標(biāo)志物、開發(fā)更好及更有效的免疫治療靶點(diǎn)以及尋找能夠和已有免疫檢查點(diǎn)抑制劑協(xié)同發(fā)揮作用的新靶標(biāo)對于TNBC的治療具有重要意義。

本研究使用GSEA軟件對CXCL13進(jìn)行單基因富集分析，結(jié)果顯示CXCL13高表達(dá)可活化B細(xì)胞受體通路、T細(xì)胞受體通路、抗原加工與提呈通路、細(xì)胞因子及其受體相互作用通路，這些通路均參與TIL的分化、遷移和活化等重要的抗腫瘤免疫生物學(xué)功能，提示CXCL13在TNBC抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著多重效應(yīng)。在TIMER數(shù)據(jù)庫中的分析發(fā)現(xiàn), CXCL13的表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈顯著正相關(guān)，提示CXCL13高表達(dá)不僅可以改善TNBC患者的預(yù)后，而且在TNBC腫瘤微環(huán)境中TIL的浸潤過程中發(fā)揮著重要作用。在TIMER數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步挖掘發(fā)現(xiàn), CXCL13表達(dá)水平與最常見的免疫檢查點(diǎn)PD-1、PD-L1和CTLA4的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，提示CXCL13的表達(dá)水平可能影響PD-1/PD-L1和CTL4單抗治療TNBC的效果。本研究使用生物信息學(xué)工具對CXCL13在TNBC中的作用進(jìn)行了深度探索，但仍需要大量基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)對本研究預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為CXCL13作為TNBC預(yù)后預(yù)測因子提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

綜上所述, CXCL13或有作為預(yù)測TNBC患者預(yù)后分子標(biāo)記物的潛力，其可能通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境中TIL的定位、浸潤和活化程度，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，協(xié)同免疫檢查點(diǎn)抑制劑在TNBC的免疫治療中發(fā)揮重要作用。