卵巢儲(chǔ)備功能減退患者卵泡液外泌體對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

沈開(kāi)元，楊冠群，羅平，代小麗，黃萍，梁媛媛，李順，陳立群，曲曉力

(柳州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，柳州 545006)

卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)能夠造成女性生育力下降甚至不孕，因此如何修復(fù)、改善女性卵巢儲(chǔ)備提高輔助生殖技術(shù)(ART)成功率是亟待解決的重要問(wèn)題之一。DOR患者生育力低下不僅體現(xiàn)在竇卵泡數(shù)的減少，而且卵泡液中活性氧(ROS)增多、卵巢顆粒細(xì)胞的異常凋亡、線粒體功能異常等也會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育潛能[1-3]。外泌體是參與細(xì)胞間通訊的膜性囊泡，細(xì)胞在正常和病理?xiàng)l件下都能分泌特異的外泌體，卵泡液中同樣存在大量的外泌體。本課題組非常關(guān)注DOR患者卵泡液外泌體是否參與調(diào)控了卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程。因此本研究嘗試通過(guò)構(gòu)建小鼠卵母細(xì)胞體外成熟模型，觀察卵母細(xì)胞成熟的相關(guān)指標(biāo)來(lái)探究外泌體對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響，以期為女性因DOR導(dǎo)致的生育功能降低和不孕癥的診療提供新的科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)4～6周齡C57BL/6J未孕雌性小鼠20只，體重25～30 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(粵)2018-0002]。動(dòng)物購(gòu)入后在人工控制環(huán)境下進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持14 h光照/10 h黑暗的光周期，室溫24℃，隨后納入實(shí)驗(yàn)。

2.卵泡液樣本：DOR患者卵泡液收集標(biāo)準(zhǔn)和方法參考之前發(fā)表論文所述方法[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤35歲，均有排卵證據(jù)；(2)月經(jīng)周期第3天竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)≤5～7個(gè)；(3)抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 ng/ml、基礎(chǔ)FSH>10 U/L。以上3項(xiàng)符合2項(xiàng)并排除輸卵管梗阻或男方因素導(dǎo)致不孕的患者納入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他女性內(nèi)外科疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)、高泌乳素血癥和盆腔輸卵管炎癥等；2)存在不良生活習(xí)慣(抽煙、酗酒等)和體重超重(體質(zhì)量指數(shù)BMI≥25 kg/m2)的患者。

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者取卵手術(shù)時(shí)收集第一管澄清無(wú)血染的卵泡液，每3個(gè)患者卵泡液樣本合并為一份，均一混合樣本用于外泌體的提取純化。本研究共收集3管上述樣本。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)柳州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查[審批號(hào)2020(KY-E-18-01)]。

3.主要試劑：外泌體提取純化試劑盒(上海宇玫博生物科技)；孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、M2培養(yǎng)液、透明質(zhì)酸酶和未成熟卵培養(yǎng)液(南京愛(ài)貝生物科技)；Dio細(xì)胞膜熒光探針試劑盒(南京凱基生物科技)；RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)以及熒光定量試劑盒(TB GreenFast qPCR Mix)(Takara，日本)。

4.主要儀器：體視顯微鏡(SMZ745，Nikon，日本)；倒置熒光顯微鏡(T2R，Nikon，日本)；qPCR儀(Lightcycler 480，Roche，瑞士)；酶標(biāo)儀(VarioskanTMLUX，Thermo，美國(guó))。

二、研究方法

1.未成熟卵母細(xì)胞收集及體外成熟培養(yǎng)(IVM)：小鼠腹腔注射PMSG 10 U，46～48 h后頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇消毒小鼠腹部，眼科剪剪開(kāi)小鼠腹部，只剪取小鼠卵巢并去除周?chē)緢F(tuán)，分離的卵巢立即轉(zhuǎn)入M2培養(yǎng)液中清洗，隨即轉(zhuǎn)入做有數(shù)個(gè)200 μl M2培養(yǎng)液微滴的培養(yǎng)皿中；在顯微鏡下用1 ml無(wú)菌注射器針頭戳破卵巢上的卵泡，用合適直徑的巴氏吸管挑選培養(yǎng)皿底部卵丘顆粒細(xì)胞完整、大小均一的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)轉(zhuǎn)入含有不同濃度外泌體的體外成熟培養(yǎng)皿中，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)；COCs體外培養(yǎng)14～16 h后評(píng)估卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展情況，隨后COCs轉(zhuǎn)入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化30 s，燒制直徑為100 μm的巴氏吸管將卵母細(xì)胞吸出，在M2培養(yǎng)液中吹打掉多余的顆粒細(xì)胞，使卵母細(xì)胞完全裸露并清洗3次，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞第一極體排出的情況。

2.卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展指數(shù)：參考Vanderhyden等[5]和Fagbohun等[6]提出的方法來(lái)評(píng)估卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展情況，卵丘擴(kuò)展評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，卵丘沒(méi)有擴(kuò)展，卵母細(xì)胞貼到培養(yǎng)皿底部；1級(jí)，只有最外層的1～2層卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展；2級(jí)，外層的卵丘顆粒細(xì)胞呈放射狀擴(kuò)展，觀察到整個(gè)COC較蓬松；3級(jí)，放射冠部分不擴(kuò)展，其余的均擴(kuò)展；4級(jí)，全部卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展。卵丘擴(kuò)展指數(shù)=[(0級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)×0)+(1級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)×1)+(2級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)×2)+(3級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)×3)+(4級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)×4)]/卵母細(xì)胞總數(shù)。

3.體內(nèi)成熟小鼠COCs收集方法：在小鼠腹腔注射PSMG 10 U，46～48 h后再次腹腔注射HCG 10 U，16 h后處死小鼠剪取小鼠的輸卵管，在M2培養(yǎng)液中清洗并在顯微鏡觀察下使用1 ml注射器針頭劃破輸卵管膨大的壺腹部讓COCs流出，收集體內(nèi)成熟COCs使用PBS清洗掉培養(yǎng)液后備用。

4.外泌體攝入驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：外泌體提取方法同樣參考之前論文所述方法[4]。卵泡液上清離心去除細(xì)胞和組織碎片，使用劑盒提取純化后添加PBS進(jìn)行重懸，并將重懸液分為每管50 μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。卵泡液外泌體用Dio熒光探針進(jìn)行染色，參考文獻(xiàn)[7-8]的方法并進(jìn)行了相應(yīng)修改，具體步驟如下：50 μl外泌體儲(chǔ)存液中添加工作濃度為1 μg/ml Dio探針，37℃孵育30 min后使用外泌體提取試劑盒的純化柱子，12 000 r/m、4℃離心10 min去除多余的熒光染料；設(shè)置含有相同濃度Dio探針的等體積PBS液體為陰性對(duì)照組，與外泌體處理組同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)處理；各挑選新鮮的10枚未成熟COCs分別放入含有工作濃度為20 μg/ml Dio標(biāo)記外泌體和陰性對(duì)照PBS的體外成熟培養(yǎng)液微滴(5枚COCs/微滴)中孵育16 h，共孵育在5%CO2、38℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行；將與外泌體共孵育后COCs轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中，37℃固定15 min，PBS清洗3次轉(zhuǎn)入500 μl Hoechst 33342中避光孵育5 min對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色；最后PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察COCs攝入外泌體的情況。

5.外泌體處理濃度篩選實(shí)驗(yàn)：卵泡液外泌體使用PBS重懸并純化后，每份外泌體樣本取20 μl并加入20 μl RIRP-PMSF(100∶1)的裂解液，冰上放置20 min后，4℃條件下12 000 r/m離心10 min，取上清液20 μl使用BCA法在酶標(biāo)儀上測(cè)定蛋白濃度；用IVM體外成熟培養(yǎng)液配制外泌體工作液，根據(jù)測(cè)定的外泌體蛋白濃度，設(shè)置不同濃度分組：0、50、100和150 μg/ml 4個(gè)濃度處理小鼠未成熟卵母細(xì)胞，每組均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。根據(jù)卵母細(xì)胞成熟情況確定外泌體的最佳添加濃度并用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

6.研究分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)組，小鼠體內(nèi)成熟的COCs為對(duì)照組(control)、小鼠COCs體外成熟過(guò)程中添加外泌體為添加組(exo+)，COCs體外成熟過(guò)程中未添加外泌體設(shè)置為未添加組(exo-)。每組每次收集COCs約25～30枚，共3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

7.熒光定量PCR：收集各組成熟后的COCs按照試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟提取總RNA后測(cè)濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR模板備用。使用熒光定量PCR的方法分別測(cè)定卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2以及凋亡因子Bax、Bcl2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，引物詳情見(jiàn)表1。采用兩步法進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性30 s(1個(gè)循環(huán))；擴(kuò)增反應(yīng)94℃ 5 s，60℃ 10 s(40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以H2A.Z作為內(nèi)參基因。

表1 引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、COCs攝入外泌體驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證COCs能否攝入卵泡液外泌體，我們將標(biāo)記有Dio染料的外泌體在COCs體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中共孵育16 h后進(jìn)行拍照觀察，結(jié)果顯示，卵丘顆粒細(xì)胞中有Dio熒光信號(hào)，而卵母細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)，說(shuō)明卵泡液外泌體能夠被卵丘顆粒細(xì)胞攝入(圖1)。

放大圖中白色三角符號(hào)示Dio標(biāo)記的外泌體。圖1 COCs攝入外泌體驗(yàn)證試驗(yàn)

二、DOR患者不同濃度卵泡液外泌體對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

不同卵丘擴(kuò)展分級(jí)情況如圖2A所示。隨著卵泡液外泌體添加濃度的升高，低卵丘擴(kuò)展等級(jí)的卵母細(xì)胞數(shù)量逐漸增多(圖2B)；此外添加不同濃度外泌體處理小鼠未成熟COCs 16 h后，各添加組COCs的卵丘擴(kuò)展指數(shù)顯著低于0 μg/ml組(P<0.05)，并且隨著濃度的升高擴(kuò)展指數(shù)逐漸降低(圖2C)。

不同濃度外泌體處理組的GV期卵母細(xì)胞百分比均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05)，而MⅡ期卵母細(xì)胞百分比均顯著低于0 μg/ml組(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)隨著外泌體濃度的增加，卵母細(xì)胞阻滯在GV期的比率呈顯著升高的趨勢(shì)，發(fā)育至MⅡ期卵母細(xì)胞的比率呈顯著降低的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)添加濃度達(dá)到150 μg/ml，體外成熟后的GV期卵母細(xì)胞百分比顯著高于0 μg/ml組，MⅡ期卵母細(xì)胞百分比則顯著低于0 μg/ml組(P<0.01)(表2)。因此選擇150 μg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。

A：卵丘擴(kuò)展級(jí)別(a：0級(jí)；b：1級(jí)；c：2級(jí)；d：3級(jí)；e：4級(jí))；B：不同濃度外泌體處理組的卵丘擴(kuò)展?fàn)顩r；C：不同濃度外泌體處理組的卵丘擴(kuò)展指數(shù)比較。與0 μg/ml組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后卵丘擴(kuò)展級(jí)別和卵丘擴(kuò)展指數(shù)

表2 不同濃度卵泡液外泌體處理對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響[n(%)]

三、外泌體對(duì)小鼠COC卵丘擴(kuò)展和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

各組小鼠COCs中卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因Has2的mRNA表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；exo+組和exo-組的Tnfaip6、Bcl2和BaxmRNA表達(dá)水平均顯著低于control組(P<0.05或P<0.01)，exo+組Ptgs2的mRNA表達(dá)水平顯著低于control組(P<0.05)；此外，exo+組Tnfaip6、Ptgs2和Bcl2的mRNA表達(dá)水平均顯著低于exo-組(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

組間比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組小鼠COCs中卵丘擴(kuò)展和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

討 論

卵巢儲(chǔ)備功能減退患者表現(xiàn)為較少的卵巢儲(chǔ)備和激素低反應(yīng)，同時(shí)也存在卵母細(xì)胞發(fā)育潛能受損的現(xiàn)象[1，9]。卵泡液含有卵母細(xì)胞發(fā)育所需的激素、蛋白質(zhì)以及轉(zhuǎn)錄因子等，為維持和促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的提供微環(huán)境。因此研究卵泡液成分的傳遞模式有助于了解影響卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育潛能的調(diào)控機(jī)制。外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)交流的重要工具，對(duì)許多細(xì)胞生命活動(dòng)都起到調(diào)控作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)卵泡液外泌體存在特異表達(dá)的非編碼RNA，輔助生殖助孕患者卵泡液外泌體存在可能與卵巢功能異常相關(guān)的微小RNA(microRNA，miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)差異表達(dá)譜[10-11]。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)與卵巢功能正常卵泡液樣本相比，DOR卵泡液中外泌體存在差異miRNA表達(dá)譜，這種表達(dá)差異也許是影響DOR患者卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能的原因之一[4]。本研究目的是了解DOR患者卵泡液外泌體是否對(duì)卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生影響，為此我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建小鼠的卵母細(xì)胞體外成熟模型，通過(guò)與DOR患者卵泡液外泌體共孵育培養(yǎng)來(lái)觀察卵母細(xì)胞成熟的變化。

卵丘擴(kuò)展和第一極體排出是卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的重要標(biāo)志，并且與卵母細(xì)胞的受精能力和發(fā)育能力密切相關(guān)[12]。在體外環(huán)境中卵丘可以在卵泡刺激素(FSH)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的刺激下發(fā)生擴(kuò)展，進(jìn)而調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[13]。因此我們選擇卵丘擴(kuò)展指數(shù)作為卵泡成熟的判斷指標(biāo)來(lái)觀察外泌體對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。我們首先使用Dio熒光探針標(biāo)記外泌體后與未成熟COCs共孵育培養(yǎng)，結(jié)果證實(shí)外泌體能夠被COCs周?chē)穆亚痤w粒細(xì)胞攝?。黄浯?，隨著外泌體濃度的升高，卵丘擴(kuò)展指數(shù)呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)，同時(shí)成熟培養(yǎng)后阻滯在GV期的卵母細(xì)胞顯著增多，發(fā)育至MⅡ期的卵母細(xì)胞顯著減少。這提示我們DOR卵泡液外泌體的加入影響了卵丘的擴(kuò)展，并阻礙了卵母細(xì)胞的核成熟。Hung等[14]認(rèn)為成熟卵泡的卵泡液外泌體可以支持卵丘顆粒細(xì)胞的擴(kuò)展。臨床研究中也發(fā)現(xiàn)PCOS患者和子宮內(nèi)膜異位癥患者的卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展能力減低、獲卵數(shù)減少[15-16]。據(jù)此我們推測(cè)DOR患者卵泡液外泌體中含有阻礙卵丘擴(kuò)展的和卵母細(xì)胞成熟的相關(guān)因子。

卵丘擴(kuò)展受到多種酶和細(xì)胞因子的調(diào)控，其中乙酰透明質(zhì)酸合酶2(HAS2)、前列腺素合成酶2(PTGS2)和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6(TNFAIP6)等是卵丘基質(zhì)形成和卵丘擴(kuò)展維持的主要調(diào)控因子。為了進(jìn)一步了解DOR卵泡液外泌體是否對(duì)卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)的基因起到抑制作用，我們檢測(cè)了與外泌體共孵育COCs中相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化。qPCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與體內(nèi)成熟的COCs相比，外泌體處理的COCs中Ptgs2和Tnfaip6表達(dá)水平均顯著降低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道人卵丘顆粒細(xì)胞中Has2影響著卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，Has2表達(dá)較高的卵母細(xì)胞受精后發(fā)育至囊胚的幾率更高，反之則容易阻滯在卵裂胚階段[17]；卵巢組織中過(guò)高的Has2表達(dá)會(huì)通過(guò)TGF-β1、VEGF及 NF-κB等信號(hào)通路作用造成PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖失控[18]。Yang等[19]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中Has2表達(dá)下調(diào)，Has2可能是PCOS導(dǎo)致的排卵障礙潛在的治療靶點(diǎn)和診斷生物標(biāo)記。我們使用DOR卵泡液外泌體處理小鼠COCs后發(fā)現(xiàn)Has2的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，提示外泌體可能沒(méi)有攜帶影響Has2的表達(dá)調(diào)控的因子。Ptgs2、Tnfaip6都是參與維持卵丘顆粒細(xì)胞間基質(zhì)的形成促進(jìn)卵丘擴(kuò)展的關(guān)鍵分子。相關(guān)研究指出，促進(jìn)Ptgs2和Tnfaip6的表達(dá)能夠有效提高體外成熟及隨后的胚胎發(fā)育效果[20-22]。子宮內(nèi)膜異位癥患者的顆粒細(xì)胞中Ptgs2的表達(dá)與正常對(duì)照相比顯著降低，抑制了卵丘擴(kuò)展從而導(dǎo)致患者獲卵數(shù)降低[16]。卵泡液外泌體也參與卵丘擴(kuò)展的調(diào)控，Hung等[14]發(fā)現(xiàn)從直徑>9 mm的牛成熟卵泡中提取的卵泡液外泌體能夠促進(jìn)小鼠和牛體外成熟卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展和相關(guān)基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)DOR卵泡液外泌體能顯著抑制小鼠COCs中Ptgs2和Tnfaip6基因的表達(dá)，這提示外泌體可能攜帶了Ptgs2和Tnfaip6基因的抑制因子從而導(dǎo)致COCs卵丘擴(kuò)展的缺陷。這可能是卵巢因素相關(guān)不孕癥患者卵母細(xì)胞成熟度和發(fā)育潛能較低的原因之一，具體的調(diào)控機(jī)制值得我們進(jìn)一步深入研究。

顆粒細(xì)胞的凋亡同樣影響著卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展和成熟。Bcl2及Bax是細(xì)胞凋亡抑制/促進(jìn)經(jīng)典的標(biāo)志基因，Bax的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡。我們檢測(cè)了小鼠COCs中Bcl2及Bax的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)外泌體抑制了體外成熟小鼠COCs中Bcl2的表達(dá)；而外泌體處理并沒(méi)有影響小鼠COCs的Bax表達(dá)。Bcl2及Bax對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控作用影響卵母細(xì)胞的成熟狀態(tài)和發(fā)育潛能[23]，在卵巢功能相關(guān)的疾病研究中，PCOS患者卵巢竇卵泡中顆粒細(xì)胞Bcl2表達(dá)下調(diào)會(huì)引起顆粒細(xì)胞凋亡增多[24]；卵巢功能不全患者經(jīng)藥物處理后顆粒細(xì)胞Bcl2表達(dá)上調(diào)、Bax表達(dá)下調(diào)，減少了細(xì)胞的凋亡從而改善了卵巢儲(chǔ)備功能[25]。此外，很多研究也證實(shí)外泌體能通過(guò)轉(zhuǎn)移非編碼RNA來(lái)調(diào)控細(xì)胞中Bcl2的表達(dá)，Deng等[26]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體攜帶的長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00461通過(guò)靶向抑制miR-15a/miR-16表達(dá)，促進(jìn)Bcl2的表達(dá)，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡；C26癌細(xì)胞系分泌的外泌體可通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-195a-5p/miR-125b-1-3p對(duì)Bcl2的負(fù)調(diào)控作用促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)了結(jié)腸癌惡病體質(zhì)引起的骨骼肌萎縮的發(fā)生過(guò)程[27]。綜上所述，我們推測(cè)DOR卵泡液外泌體通過(guò)調(diào)控Bcl2介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程，并且造成卵丘擴(kuò)展和卵母細(xì)胞成熟阻滯。

本研究發(fā)現(xiàn)DOR患者卵泡液外泌體能夠抑制小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中卵丘擴(kuò)展和減數(shù)分裂恢復(fù)的現(xiàn)象，并且對(duì)卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因Ptgs2和Tnfaip6和細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl2產(chǎn)生了顯著的抑制效果；據(jù)此推測(cè)DOR患者卵泡液中外泌體可能通過(guò)轉(zhuǎn)移miRNA調(diào)控卵丘擴(kuò)展和顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。我們今后將進(jìn)一步挖掘外泌體非編碼RNA的作用機(jī)制，為卵巢儲(chǔ)備功能減退和卵母細(xì)胞發(fā)育潛能降低所致不孕患者的診療提供新的思路。