冷凍卵巢組織移植研究進(jìn)展

華蓬勃，楊怡卓，李芳菲，彭紅梅*

(1.北京市門頭溝區(qū)婦幼保健院，北京 102300；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心，北京 100039)

不孕癥目前已成為繼癌癥、心血管疾病的第三大疾病，全球包括我國(guó)的患病率逐年增高，其中卵巢因素導(dǎo)致不孕是主要原因之一。卵巢早衰、卵巢先天發(fā)育異常、婦科惡性腫瘤放化療后導(dǎo)致卵巢不可逆的損傷、其他系統(tǒng)惡性腫瘤全身治療后卵巢無功能等導(dǎo)致越來越多的年輕患者失去生育能力及面臨內(nèi)分泌失調(diào)等問題，從而給自身及家庭的生活帶來壓力。目前保存生育力的方式有卵子冷凍、胚胎冷凍、卵巢移植等，其中胚胎冷凍及卵子冷凍已相對(duì)成熟[1]，而卵巢移植與其他兩種方法相比，有其特有的優(yōu)勢(shì)，不僅可以為年輕患者保留生育功能，還可以解決其內(nèi)分泌相關(guān)問題。

隨著器官移植技術(shù)的飛速發(fā)展，卵巢移植是逐漸興起的一種挽救卵巢早衰、卵巢惡性腫瘤等年輕患者生育能力的手段。但目前卵巢移植臨床實(shí)踐應(yīng)用中仍面臨諸多問題，例如移植后大量卵泡的丟失導(dǎo)致卵巢壽命較短甚至移植后卵巢無功能、異體移植術(shù)后因免疫排斥反應(yīng)可能需要長(zhǎng)期口服免疫抑制劑以及倫理問題等諸多因素，均限制了卵巢移植的進(jìn)展，需要更多的臨床研究推動(dòng)卵巢移植的發(fā)展。本文綜述了冷凍卵巢組織移植的研究進(jìn)展，包括卵巢組織移植的類型、移植部位的選擇、如何改善移植成功率、移植后的免疫抑制劑的應(yīng)用等。

一、卵巢組織移植的類型

卵巢移植類型包括：自體移植、同種異體移植、異種移植。

1.自體移植：對(duì)于惡性腫瘤需要全身放化療的患者，可以在治療前進(jìn)行卵巢組織冷凍，在放化療結(jié)束后進(jìn)行自體卵巢移植。其優(yōu)點(diǎn)為無免疫排斥反應(yīng)、無需使用免疫抑制劑、術(shù)后并發(fā)癥少，但對(duì)于卵巢無功能的患者或患有某些惡性腫瘤，其卵巢組織中存在惡性腫瘤的患者等均無法行自體移植。2021年我國(guó)首例骨髓異常增生綜合征的患者在骨髓移植后進(jìn)行自體卵巢移植，術(shù)后3個(gè)月恢復(fù)自然月經(jīng)，術(shù)后1年余后順利妊娠并分娩活嬰[2]，為自體卵巢移植的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

2.同種異體移植：對(duì)于卵巢早衰、無功能的患者，或患有某些惡性腫瘤，其卵巢組織中存在惡性腫瘤的患者等，均無法進(jìn)行自體移植。此類患者要想解決內(nèi)分泌及生育需求，可以進(jìn)行供卵-體外受精胚胎移植以及激素替代治療。但是對(duì)于存在激素替代治療禁忌癥的患者，可以考慮異體移植，同時(shí)解決內(nèi)分泌以及生育需求。我國(guó)1996年陳誦芬等[3]對(duì)1例男性假兩性畸形患者行同種異體卵巢移植術(shù)，患者術(shù)后3個(gè)月月經(jīng)來潮，術(shù)后1年卵巢仍存在功能。2009年Silber[4]對(duì)其中一人患有卵巢早衰的10對(duì)單卵雙胎姐妹進(jìn)行了研究，雙胎姐妹間的同種異體卵巢移植讓卵巢早衰姐妹獲得了10次自然妊娠，最終7例活產(chǎn)。此研究的成功，為單卵雙胎的姐妹之一出現(xiàn)卵巢功能衰竭提供了較好的治療方案，既可以恢復(fù)卵巢功能，又避免了長(zhǎng)期口服免疫抑制劑以及激素替代治療。但對(duì)于想要對(duì)無血緣關(guān)系的患者間進(jìn)行異體卵巢移植，均需面臨長(zhǎng)期口服免疫抑制劑以及倫理等相關(guān)問題。

3.異種移植：目前尚無人類相關(guān)的異種卵巢組織移植相關(guān)報(bào)道。

2021年Dolmans等[5]回顧了歐洲五大中心285名婦女冷凍卵巢組織移植的結(jié)局，幾乎所有接受自體卵巢組織移植的婦女都能看到內(nèi)分泌功能的恢復(fù)，大約25%的婦女會(huì)生下一個(gè)健康的孩子。這些研究數(shù)據(jù)，標(biāo)志著生殖技術(shù)的飛速發(fā)展，且捐贈(zèng)器官愛心人士較前明顯增多，均為卵巢移植的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

二、冷凍卵巢組織移植部位的選擇及方法

卵巢移植的部位可以分為兩大類：原位移植以及異位移植。無論是自體移植、同種異體移植以及異種卵巢移植，移植部位的選擇及方法是一致的。

1.原位移植：將卵巢組織移植回至原始卵巢所在的盆腔中，稱原位移植。原位移植的卵巢組織被重新植入其原來的生理環(huán)境中，更有利于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，且可不需要輔助生殖即可自然受孕，如需促排、取卵、體外受精等輔助生殖操作也更容易簡(jiǎn)便。但也有其劣勢(shì)所在，如患者盆腔粘連較重，將導(dǎo)致手術(shù)困難甚至無法進(jìn)行原位移植。卵巢組織的原位移植一般在術(shù)后 2～9個(gè)月可檢測(cè)到卵巢活性，最多可持續(xù)7年之久，此類研究已獲得多個(gè)成功妊娠的案例[6]。

卵巢組織原位移植常見的部位為卵巢表面原位移植、闊韌帶腹膜口袋移植等。卵巢表面原位移植要求患者至少存在一側(cè)卵巢，可將患者卵巢皮質(zhì)層切開，暴露髓質(zhì)的整個(gè)血管網(wǎng)絡(luò)，將卵巢皮質(zhì)用7-0或8-0 propylene線固定，或簡(jiǎn)單放置在卵巢髓質(zhì)上，表面覆蓋Interceed[7]。2011年Donnez等[8]報(bào)道了一例特納綜合征患者進(jìn)行同種異體雙胞胎卵巢皮質(zhì)原位移植，移植后3個(gè)月實(shí)現(xiàn)卵巢功能恢復(fù)，常規(guī)周期7個(gè)月后，發(fā)生自然妊娠，孕38周時(shí)分娩了一名體重2 850克的健康女嬰。

如患者無雙側(cè)卵巢可行闊韌帶腹膜口袋移植，在闊韌帶前葉做一個(gè)腹膜窗口，可見血管網(wǎng)區(qū)域，供者皮質(zhì)碎片放置在窗口中，隨后覆蓋Interceed[9]。

2.異位移植：將患者卵巢組織移植到盆腔以外的部位，稱為異位移植。其手術(shù)操作簡(jiǎn)單，對(duì)于盆腔粘連較重的患者或惡性腫瘤放療后盆腔血供條件較差的患者，均無法行原位移植，可行異位移植。但異位移植也有其劣勢(shì)所在，其生存的微環(huán)境不利于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育以及恢復(fù)卵巢功能，且術(shù)后無法自然受孕，均需進(jìn)行輔助生殖。

卵巢皮質(zhì)異位移植常見部位為前臂、大腿、腹直肌與鞘之間等。2001年Oktay等[10]報(bào)道了2例惡性腫瘤患者進(jìn)行卵巢皮質(zhì)異位移植到前臂的成功的案例。因當(dāng)時(shí)缺乏大齡患者的卵巢組織冷凍技術(shù)，所以在放化療前將患者的卵巢皮質(zhì)自體異位移植至前臂，避開放療區(qū)域后進(jìn)行放化療，成功保留了患者的內(nèi)分泌功能。具體方法：將切除卵巢制備成16條卵巢皮質(zhì)，在腕橈肌前窩下方5 cm處做一個(gè)1 cm的垂直切口，采用縫合拉穿技術(shù)在皮下插入卵巢帶。2012年Kim[11]報(bào)道了5名癌癥患者卵巢組織異位移植的壽命研究，用3-0 Vicry縫線將8～10片卵巢皮質(zhì)貫穿于線上，局麻下切開皮膚約2 cm切口移植到腹直肌與和鞘之間，進(jìn)行患者內(nèi)分泌的監(jiān)測(cè)，最長(zhǎng)維持了7年。

因異位移植將會(huì)有空卵泡的大量產(chǎn)生、卵泡的停止發(fā)育、受精率的降低等等問題，其原因可能與環(huán)境溫度的不同、血供的不同等相關(guān)，截止至目前研究報(bào)道異位移植后活產(chǎn)率很少。2015年Youm等[12]分析比較了小鼠卵巢移植的原位移植及異位移植，結(jié)果表明原位移植的卵泡存活多，移植成功率更高。

三、添加外源性物質(zhì)來改善移植的成功率

冷凍卵巢組織移植成功率受多種因素的影響，其中最重要的是冷凍及移植過程中卵泡的丟失的問題。卵巢組織移植后，局部缺血可持續(xù)3～7 d，這種缺血導(dǎo)致的卵泡丟失仍然是目前卵巢組織移植面臨的嚴(yán)峻問題。移植后決定卵巢壽命的重要因素是存活下來的原始卵泡的數(shù)量[13]，而冷凍卵巢皮質(zhì)中較多休眠卵泡在移植后丟失，因此盡可能在此時(shí)期減少卵泡的損傷至關(guān)重要[14]。隨著國(guó)內(nèi)研究的進(jìn)展，冷凍卵巢組織移植后卵巢功能恢復(fù)的成功率以及之后的妊娠率及活產(chǎn)率均較以往明顯上升[15]，為卵巢冷凍移植技術(shù)的發(fā)展打下了基礎(chǔ)。為盡量減少冷凍以及移植過程導(dǎo)致卵泡的丟失，可增加外源性物質(zhì)來改善移植的成功率。既往有多項(xiàng)研究報(bào)道，具體如下。

1.生長(zhǎng)因子：卵巢皮質(zhì)移植因沒有血管吻合，移植后的存活與否在于血運(yùn)重建，所以移植后加快血運(yùn)重建、減少組織缺氧時(shí)間可以減少卵泡的丟失。目前有多種生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)血管的生成，研究較多的有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等。

VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)的變性、內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、增殖和血管形成等作用。VEGF是一個(gè)家族，VEGF-A是其一員，可以促進(jìn)新生血管形成和使血管通透性增加，為一種有效的血管生成因子，進(jìn)而提高移植卵巢組織的卵泡存活率[16]。bFGF一般由巨噬、平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，bFGF可以促進(jìn)血管的生成。bFGF可以增加卵巢組織CD31表達(dá)，使同種異體移植卵巢組織中卵泡密度明顯增加[17]。2013年有研究將小鼠進(jìn)行同種異體卵巢移植后使用VEGF、bFGF以及兩種生長(zhǎng)因子聯(lián)合，觀察對(duì)卵泡的存活及血管重建的作用，結(jié)果表明單獨(dú)使用bFGF或VEGF均可以促進(jìn)卵巢血管的重建，兩種生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用效果更佳[18]，可以使血管的密度與卵泡數(shù)量明顯增多，兩種生長(zhǎng)因子起到了協(xié)同的作用。

2.激素因子：在卵巢組織移植過程中，多項(xiàng)研究表明各種激素的使用對(duì)卵泡的存活也發(fā)揮了很好的保護(hù)作用，包括卵泡刺激素(FSH)、雄激素、人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)、抗苗勒管激素(AMH)、黃體生成素(LH)等。在移植前用FSH或HMG培養(yǎng)卵巢組織，可使移植后卵巢組織的VEGF和bFGF的表達(dá)增強(qiáng)及血管密度增加，從而提高卵泡生存率[19]。AMH在控制性分化和卵泡發(fā)育起關(guān)鍵作用[20]，雖然AMH長(zhǎng)期以來作為卵巢儲(chǔ)備的一個(gè)重要指標(biāo)，但最近也被作為一種保護(hù)劑研究[21]。有研究表明使用AMH可以明顯減少卵巢移植后的卵泡丟失[22]。既往有研究報(bào)道小鼠的卵母細(xì)胞在雄性受體中可以成功受精后活產(chǎn)，雄性小鼠體內(nèi)的激素環(huán)境可以支持具有發(fā)育能力的卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]。而在人類卵巢移植中，雄激素的應(yīng)用還沒有相關(guān)報(bào)道，需進(jìn)一步研究。2020年Zheng等[24]報(bào)道LH可通過在卵巢冷凍保存和移植過程中上調(diào)VEGF、Cx43和Cx37的表達(dá)來促進(jìn)卵巢的存活和功能。

3.1-磷酸鞘氨醇(S1P)：S1P是一種抑制凋亡的因子，抑制放化療引起的細(xì)胞凋亡[25]。2011年有研究報(bào)道S1P對(duì)人卵巢移植后早期血管生成的影響，結(jié)果表明S1P可以增加血管的密度、促進(jìn)血管的生成，進(jìn)而改善人卵巢皮質(zhì)組織移植過程中的原始卵泡存活率[26]。也有研究報(bào)道對(duì)冷凍卵巢移植的小鼠進(jìn)行S1P干預(yù)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行S1P干預(yù)的小鼠原始及初級(jí)卵泡較多，抵抗移植對(duì)卵巢的損傷，降低了移植后卵泡凋亡的發(fā)生率[27]。還有研究提出，卵巢玻璃化凍存過程 中FSH 聯(lián)合 S1P的干預(yù)可抑制卵泡閉鎖[28]。

4.間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)：MSCs通過釋放血管生成因子、分化多種組織細(xì)胞，在支持新血管生成和穩(wěn)定方面起重要作用。MSCs可以提高VEGF、血管生成素的水平，刺激新血管形成，并增加冷凍保存的卵巢組織移植后的血液灌注，明顯降低原始卵泡的死亡率從而減少了卵泡的丟失[29]。有研究在大鼠卵巢自體移植過程中加入脂肪MSCs后，原始卵泡及卵泡總數(shù)均較無添加卵巢移植組增多，而細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，表明大鼠脂肪MSCs可以改善卵巢移植的成功率，延長(zhǎng)移植后的卵巢壽命[30]。異體移植尚未見相關(guān)報(bào)道，但異體移植可考慮使用MSCs提高移植成功率。

5.富含血小板的血漿(PRP)：PRP中血小板濃度非常高，其生長(zhǎng)因子濃度可為血漿的3～5倍，其中的各種生長(zhǎng)因子在細(xì)胞分化與增殖中起著非常重要作用，還可以促進(jìn)血管的生成[31]。在既往不同的研究中，各種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有應(yīng)用PRP來促進(jìn)血管生成并取得成功的案例。富含血小板的纖維蛋白(PRF)是一種富含血小板的血液衍生物。PRF釋放細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)血管生成，抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥，從而減少缺血再灌注損傷。2019年國(guó)外有研究對(duì)自體卵巢移植的小鼠在移植部位使用PRF生物支架，結(jié)果顯示其細(xì)胞凋亡率和炎癥因子濃度顯著降低[32]。

6.抗氧化因子：內(nèi)源性抗氧化因子可以中和在缺血應(yīng)激期間過量產(chǎn)生的氧自由基。目前應(yīng)用的外源性抗氧化劑有抗壞血酸、褪黑素、維生素C、維生素E等，能減輕一定的程度的血管內(nèi)皮損傷，但目前應(yīng)用有限，有較大的爭(zhēng)議[29]。褪黑素在線粒體水平上具有抗炎及抗氧化作用，2021年國(guó)外有研究將雌性大鼠的卵巢進(jìn)行褪黑素介質(zhì)中冷凍，與標(biāo)準(zhǔn)冷凍法相比，卵巢移植的質(zhì)量更高[33]，關(guān)于生育能力的影響有待進(jìn)一步研究。

四、異體卵巢組織移植后的免疫抑制劑的應(yīng)用

自體卵巢組織移植或單卵雙胎姐妹間的異體卵巢組織移植因無免疫排斥反應(yīng)，無需使用免疫抑制劑。但無血緣關(guān)系患者間的異體卵巢組織移植及異種卵巢組織移植，因免疫排斥反應(yīng)必然存在，均需長(zhǎng)期口服免疫抑制，所以免疫抑制劑的應(yīng)用是保證移植成功的關(guān)鍵因素之一。由于卵巢并非人體救命的器官，而免疫抑制劑又均有各種毒副作用，進(jìn)而限制了人類異體卵巢移植的進(jìn)展。最理想的移植方案應(yīng)該是安全的，確保受者可以長(zhǎng)期接受供體的卵巢，恢復(fù)內(nèi)分泌功能及完成生育需求。那么安全有效的免疫抑制劑的應(yīng)用，顯得非常重要。雖然目前沒有成熟的免疫抑制方案應(yīng)用于卵巢移植，但目前國(guó)內(nèi)外肝臟以及腎臟的移植非常普遍，免疫抑制劑應(yīng)用非常成熟，且均有較多肝、腎臟移植后患者成功妊娠活產(chǎn)的案例。

目前臨床應(yīng)用的免疫抑制劑大致分為6類：細(xì)胞因子合成抑制劑，包括環(huán)孢菌素(CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素(RAPA)等；DNA合成抑制劑，包括硫唑嘌呤(AZA)、霉酚酸酯(MMF)、咪唑立賓(MZR)等；腎上腺皮質(zhì)類固醇藥物，如甲基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松等；抗淋巴細(xì)胞抗體類藥物，如甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等；植物藥類，包括FTY720、雷公藤多苷等。由于目前已發(fā)表的關(guān)于人類的同種異體卵巢移植研究較少，免疫抑制劑應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)不足，尚無統(tǒng)一意見。

1.環(huán)孢菌素A(CsA)：在1987年有研究對(duì)大鼠進(jìn)行卵巢輸卵管同種異體移植，使用CsA作為免疫抑制劑，術(shù)后成功產(chǎn)下后代[34]。在1993年有研究對(duì)兔子進(jìn)行同種異體卵巢移植，同樣將環(huán)孢素作為免疫抑制劑，應(yīng)用環(huán)孢菌素組與未應(yīng)用組比較，存活率及成功率明顯升高[35]。其主要毒副作用為腎毒性、高血糖、高血壓、高血脂等。

2.他克莫司(FK506)：作用機(jī)制與CsA類似，目前已成為腎移植、肝臟移植受體的主要免疫抑制劑。2020年我國(guó)發(fā)表的12例腎移植患者術(shù)后成功妊娠，孕期的免疫抑制方案為他克莫司和潑尼松以及硫唑嘌呤，分娩的新生兒均無出生缺陷，隨訪一年余，子代的生長(zhǎng)及心理發(fā)育、學(xué)習(xí)能力及智力與同齡人均無明顯差異[36]。其主要毒副作用有高血壓、頭痛、低磷血癥、震顫、骨質(zhì)疏松等。

3.霉酚酸酯(MMF)：可選擇性抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖和功能。2020年國(guó)外報(bào)道了2例恒河猴子宮異體移植后成功恢復(fù)功能，應(yīng)用了霉酚酸酯(MMF)、環(huán)孢菌素以及他克莫司免疫抑制治療，術(shù)后無排異反應(yīng)，2個(gè)月后恢復(fù)月經(jīng)[37]。其主要毒副作用為敗血癥、感染、白細(xì)胞降低等。

4.腎上腺皮質(zhì)激素：具有溶解免疫活性細(xì)胞、阻斷細(xì)胞分化從而達(dá)到抗炎、抗免疫的作用。我國(guó)早在1996年發(fā)表了一例人類卵巢成功移植的案例報(bào)道[3]，研究中是一位男性假兩性畸形患者進(jìn)行異體卵巢移植，使用的免疫抑制劑為環(huán)磷酰胺、地塞米松及強(qiáng)的松，術(shù)后未出現(xiàn)排異反應(yīng)，1年后卵巢功能仍正常。其主要副作用為骨質(zhì)疏松、電解質(zhì)紊亂、高血壓、高血糖、肌肉萎縮等。

5.免疫調(diào)節(jié)劑胚胎植入前因子(PIF)：PIF也可以防止器官排異反應(yīng)并且恢復(fù)器官功能[38]。PIF是一種由活胚胎分泌的肽，該肽的功能包括無抑制的免疫調(diào)節(jié)和無排斥的移植接受。2018年有研究采用PIF作為單一療法使進(jìn)行同種異體卵巢移植的狒狒成功恢復(fù)了卵巢功能[38]，但其狒狒為野外獲得，不除外其遺傳的相關(guān)性，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其可行性。

五、小結(jié)與展望

卵巢移植技術(shù)可以讓患者獲得生育以及內(nèi)分泌功能，但仍有很多需要待解決的問題，例如如何減少卵泡丟失而提高移植后卵巢的長(zhǎng)期功能，如何更好地使用免疫抑制劑，既能達(dá)到抗免疫排斥反應(yīng)，又能減輕患者以及后代的影響。目前卵巢組織移植仍然是一種正在發(fā)展中的技術(shù)，但深入的研究可能會(huì)將這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展成一種成熟的保護(hù)生育能力的方法。