飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在中國人常見耳聾基因檢測中的應(yīng)用

金孝華，黃莎莎，龐珊珊，戴樸，高華方，馬旭*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100005；3.中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853)

耳聾是最常見的出生缺陷性疾病之一，同時(shí)也是人類最常見的感覺功能障礙之一。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒雙側(cè)聽力障礙(≥40 dB)發(fā)病率超過0.1%，隨著遲發(fā)性聽力障礙增加，到青春期發(fā)病率則高達(dá)0.35%[1]?！吨袊錾毕莘乐螆?bào)告(2012)》明確指出，2008至2010年我國先天聽力障礙發(fā)生率分別為19.9/萬、21.5/萬和21.9/萬，呈逐年上升趨勢[2]。目前研究表明，約60%的耳聾與遺傳因素有關(guān)，遺傳性耳聾約70%為非綜合征型，其余為綜合征型，遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性和廣泛的種族差異[3]。根據(jù)中國聾病分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，我國耳聾人群的主要致病基因是GJB2[4]、SLC26A4[5-6]和線粒體基因12SrRNA[7]。目前，新生兒聽力與耳聾易感基因聯(lián)合篩查作為有效的遺傳性耳聾三級預(yù)防手段，已在全國多個(gè)省市開展并且取得成效，其中4個(gè)耳聾基因9個(gè)位點(diǎn)及4個(gè)耳聾基因20個(gè)位點(diǎn)的篩查方案應(yīng)用較廣[8-9]。為了進(jìn)一步提高聾病易感基因突變篩查的效率及基因診斷確診率，本研究利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)建立了單一反應(yīng)檢測3個(gè)常見耳聾基因(GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA)30個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的方法，并使用臨床樣本對該方法的準(zhǔn)確性和有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年8月至2017年2月于中國人民解放軍總醫(yī)院就診的700例(327例已知突變位點(diǎn)，373例未進(jìn)行基因檢測)非綜合征耳聾患者為研究對象。

327例已知突變位點(diǎn)的非綜合征型耳聾患者DNA樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)：樣本已經(jīng)過常見耳聾基因GJB2、SLC26A4和12SrRNA檢測，至少攜帶一個(gè)本研究待檢測的突變位點(diǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：樣本DNA濃度低于10 ng/μl，或者260/280<1.7或260/280>1.9，即樣本DNA質(zhì)量不能滿足飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測試劑要求。

373例未進(jìn)行基因檢測的非綜合征型耳聾患者全血樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)體格檢查、?？茩z查及聽力學(xué)檢查臨床診斷為非綜合征型耳聾的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性或慢性中耳炎、外中耳畸形、聽神經(jīng)瘤、晚期梅尼埃病、耳毒性藥物、腦膜腦炎、新生兒高膽紅素血癥、母親孕期宮內(nèi)感染、外傷等有明確致聾原因的患者。

所有研究對象均簽署知情同意書，研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.DNA提?。翰捎醚?細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物)提取非綜合征型耳聾患者全血基因組DNA，提取方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用核酸定量儀(Nano Drop 2000，Thermo Fisher，美國)進(jìn)行基因組DNA定量和純度測定。

2.飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測耳聾致病基因突變方法的建立：根據(jù)我國聾病分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，選擇中國人群常見耳聾基因GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA共30個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(表1)，建立單一反應(yīng)MALDI-TOF MS檢測耳聾致病基因熱點(diǎn)突變的方法。具體步驟如下：(1)多重PCR擴(kuò)增：利用Assay Design 4.0軟件(Agena Bioscience，美國)進(jìn)行多重PCR引物和單堿基延伸引物設(shè)計(jì)，多重PCR反應(yīng)體系為5 μl，包括10×PCR Buffer 0.5 μl、25 mmol/L MgCl20.4 μl、25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μl、0.5 μmol/L引物1 μl、5 U/μl PCR酶0.2 μl、ddH2O 1.8 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)熱2 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保持。(2)蝦堿性磷酸酶(SAP)處理：向5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μl SAP混合液，包括1.7 U/μl SAP 0.3 μl、SAP buffer 0.17 μl、ddH2O 1.53 μl。反應(yīng)條件為：37℃ 40 min；85℃ 5 min；4℃保持。去除未結(jié)合的dNTP。(3)單堿基延伸反應(yīng)：向SAP處理后的PCR產(chǎn)物中加入配制好的單堿基延伸反應(yīng)混合液2 μl，包括Buffer 0.2 μl、ddNTP Mix 0.2 μl、單堿基延伸引物0.94 μl、iPLEX單堿基延伸酶0.041 μl、ddH2O 0.619 μl。延伸條件為：94℃ 30 s；94℃ 5 s，(52℃ 5 s、80℃ 5 s，5個(gè)循環(huán))，40個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min；4℃保持。(4)MALDI-TOF MS檢測：將單堿基延伸產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽、樹脂純化后，利用MassARRAY RS1000/Fusio 點(diǎn)樣儀(Agena Bioscience，美國)轉(zhuǎn)移到芯片上，采用MassARRAY質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)(Agena Bioscience，美國)進(jìn)行檢測，使用Typer 4.0軟件(Agena Bioscience，美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)突變位點(diǎn)由于單堿基延伸產(chǎn)物分子量不同，形成不同的檢測峰而被區(qū)分(圖1)。

表1 耳聾基因GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA的30個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)

3.Sanger測序驗(yàn)證：在耳聾致病基因突變位點(diǎn)周圍設(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)后獲得目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物，采用BigDye 3.1(ABI，美國)測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法純化后在ABI 3730×l測序儀(ABI，美國)上進(jìn)行序列分析。

A：GJB2基因c.235delC雜合突變型峰圖；B：GJB2基因c.235delC野生型峰圖；C：質(zhì)譜聚類圖圖1 MALDI-TOF MS檢測耳聾基因GJB2的檢測結(jié)果示例圖

結(jié) 果

一、建立檢測常耳聾致病基因熱點(diǎn)突變的單一反應(yīng)MALDI-TOF MS方法

采用單一反應(yīng)MALDI-TOF MS對327例已知突變的非綜合征型耳聾樣本(所攜帶的突變涵蓋了本研究要檢測的GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因30個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)至少有8個(gè)以上陽性突變)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因共30個(gè)突變位點(diǎn)在327例已知突變樣本中均檢出，其檢測結(jié)果與臨床基因診斷結(jié)果一致，符合率為100%，說明單一反應(yīng)MALDI-TOF MS檢測常見耳聾治病基因(GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA)的方法已成功建立。

二、利用新建立的單一反應(yīng)MALDI-TOF MS檢測未知突變非綜合征型耳聾患者樣本的質(zhì)譜結(jié)果

利用新建立的單一反應(yīng)MALDI-TOF MS檢測373例未知突變位點(diǎn)的非綜合征型耳聾患者樣本發(fā)現(xiàn)，56.30%(210/373)患者至少攜帶1個(gè)突變，其中基因診斷確診攜帶復(fù)合或純合突變的患者為155例，占受檢人群的41.55%(155/373)，只檢測到1個(gè)突變的患者55例，占受檢人群的14.75%(55/373)，未檢測到突變的患者163例，占受檢人群的43.70%(163/373)。210例陽性突變攜帶者共涉及55種基因型，其中有5例存在多個(gè)基因突變，GJB2基因突變陽性患者93例，占受檢人群的24.93%(93/373)，SLC26A4基因突變陽性患者118例，占受檢人群的31.64%(118/373)，12SrRNA基因m.1555A>G突變占受檢人群的1.07%(4/373)(表2)。

三、Sanger測序驗(yàn)證

根據(jù)373例未知突變位點(diǎn)的非綜合征型耳聾患者樣本的MALDI-TOF MS結(jié)果，針對每個(gè)檢出的突變位點(diǎn)分別選擇部分陽性結(jié)果樣本總計(jì)56例進(jìn)行Sanger一代測序驗(yàn)證，Sanger一代測序結(jié)果與新建立的MALDI-TOF MS檢測結(jié)果一致，符合率為100%。

表2 MALDI-TOF MS檢測應(yīng)用于373例非綜合征型耳聾患者耳聾基因突變檢測結(jié)果

續(xù)表

討 論

耳聾是臨床上導(dǎo)致言語交流障礙的常見致殘性疾病。中國人群GJB2基因突變的攜帶率為3.16%，SLC26A4基因突變的攜帶率為2.75%，線粒體12rRNA突變的攜帶率為2.87‰，GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA是導(dǎo)致我國耳聾高發(fā)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的耳聾基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐證明，耳聾基因檢測對于耳聾的預(yù)防、治療具有重要作用[10]。

目前，耳聾基因檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床耳聾基因診斷和新生兒耳聾基因篩查，所采用的檢測技術(shù)包括基因芯片[11]、多色探針熔解曲線分析技術(shù)[12]、SNPscan技術(shù)[13]、MALDI-TOF MS[14-15]、新一代測序[16]等。其中MALDI-TOF MS為非雜交依賴性，不需要各種標(biāo)記物，直接以分子量為標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測和DNA突變檢測[17]。MALDI-TOF MS與其他針對已知突變的基因檢測技術(shù)相比具有以下技術(shù)優(yōu)勢[18]：(1)通量高。MALDI-TOF MS檢測1張384個(gè)樣品的芯片需要時(shí)間約1 h，一臺儀器每天可以檢測2 000個(gè)以上樣品，更適合大規(guī)模人群耳聾基因篩查工作開展；(2)準(zhǔn)確率高。MALDI-TOF MS技術(shù)原理上相當(dāng)于微測序反應(yīng)，而且不需要任何標(biāo)記物，直接通過分子量大小進(jìn)行基因分型，結(jié)果準(zhǔn)確；(3)成本低。不需要熒光標(biāo)記，相對于SNPscan、芯片法等檢測方法其檢測成本低；(4)突變檢測位點(diǎn)多，覆蓋率高。本研究建立的方法可以單一反應(yīng)檢測3個(gè)耳聾基因30個(gè)突變位點(diǎn)，與其它突變檢測技術(shù)如多色探針熔解曲線分析技術(shù)、Sanger測序等一個(gè)反應(yīng)只能檢測一個(gè)或幾個(gè)突變位點(diǎn)相比，極大地提高了耳聾基因突變檢出率。目前MALDI-TOF MS除了應(yīng)用于耳聾基因檢測外，也有研究者將其用于囊性纖維化[19]、苯丙酮尿癥[20]等遺傳病熱點(diǎn)突變檢測。在國內(nèi)已有研究者利用MALDI-TOF MS開展中國人耳聾基因熱點(diǎn)突變檢測，如Yao 等[14]采用MALDI-TOF MS單一反應(yīng)檢測GJB2和SLC26A4基因14個(gè)突變位點(diǎn)。曾云 等[15]同樣利用該技術(shù)單一反應(yīng)檢測4個(gè)耳聾基因20個(gè)位點(diǎn)。本研究所建立的MALDI-TOF MS方法將檢測的耳聾基因突變位點(diǎn)增加到30個(gè)，對373例未基因診斷的非綜合征型耳聾患者進(jìn)行檢測，在受檢者中發(fā)現(xiàn)了56.30%(210/373)的陽性攜帶者，其中攜帶復(fù)合雜合或純合突變可以明確基因診斷的患者占受檢人群的41.55%(155/373)。與Yao等[14]和曾云 等[15]的方法相比，本研究的方法有效提高了耳聾基因突變檢出率和臨床確診率，特別是改善了前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大(EVAS)主要致病基因SLC26A4的臨床確診率。SLC26A4 基因較大，共有21個(gè)外顯子，編碼區(qū)有20個(gè)外顯子，如果在只檢出一個(gè)突變情況下，對其確診最多需要做18個(gè)直接測序反應(yīng)，成本和工作量都很大。有研究認(rèn)為，如果將SLC26A4基因檢測突變位點(diǎn)增加到15個(gè)，EVAS患者的SLC26A4 基因突變的陽性檢出率能夠達(dá)到89.8%，臨床確診率可以達(dá)到60.41%，基本可滿足臨床需求[21]。本研究建立的MALDI-TOF MS方法包含了SLC26A4基因19個(gè)熱點(diǎn)突變，能很好滿足臨床需求。

本研究建立了基于MALDI-TOF MS的高通量耳聾基因檢測方法，可以單一反應(yīng)檢測耳聾基因GJB2、SLC26A4和線粒體12rRNA的30個(gè)熱點(diǎn)突變，通過大量臨床樣本證明了該方法的準(zhǔn)確性和有效性，該方法改善了聾病易感基因突變篩查的效率及基因診斷確診率，可廣泛應(yīng)用于臨床耳聾基因診斷和新生兒耳聾基因篩查，為耳聾預(yù)防工作提供重要的技術(shù)支持。