NNMT在大腸腺癌與大腸腺瘤的表達(dá)對比及對大腸腺癌短期生存的影響＊

王超 陳見蘇 劉蘭仔

當(dāng)前研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展屬于一個較為復(fù)雜的過程與階段，實(shí)際是由各類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)失?；蛑T多腫瘤抑制基因失活引起，因此，在臨床工作中若需要了解整個腫瘤癌變過程中的基因表現(xiàn)以及基因動態(tài)改變，則需要研究整個基因組在癌癥進(jìn)展過程中的改變及其所帶來的基因表達(dá)動態(tài)變化[1-2]。在既往的臨床工作中，采用了基因芯片對腎癌及其癌旁組織進(jìn)行了相應(yīng)的大規(guī)?；蚝Y查試驗(yàn)及相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NNMT）在腎癌等組織中呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，且其表達(dá)水平明顯高于周圍正常組織[3]。同時有研究對NNMT在各類消化系統(tǒng)癌癥疾病中的研究進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NNMT在諸多腫瘤組織中也呈現(xiàn)出異常升高的改變水平，且與癌旁組織相比明顯升高[4]。本研究就NNMT在大腸腺癌與大腸腺瘤的表達(dá)及大腸腺癌的預(yù)后進(jìn)行分析，旨在為疾病的治療及預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月-2019年2月福建省立醫(yī)院南院外科手術(shù)或內(nèi)鏡下取材的正常大腸黏膜、大腸腺瘤及大腸腺癌各50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者因疑似大腸病變來院接受檢查；生命體征平穩(wěn)，認(rèn)知功能正常；具有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類型的腫瘤性疾病、消化系統(tǒng)疾??；對本研究試驗(yàn)不耐受或持反對態(tài)度。正常大腸黏膜組，男28例，女22例；年齡20～72歲，平均（56.25±4.12）歲。大腸腺瘤組，男27例，女23例；年齡22～73歲，平均（56.80±4.02）歲。大腸腺癌組，男26例，女24例；年齡23～70歲，平均（56.10±4.92）歲。三組一般資料相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本次試驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)倫理會審核批準(zhǔn)，患者知情同意本次試驗(yàn)。

1.2 方法

采用S-P免疫組化技術(shù)對NNMT進(jìn)行檢測，方法：將正常大腸黏膜、大腸腺瘤及大腸腺癌組織留取部分標(biāo)本放入福爾馬林溶液中，將其送病理檢查由此進(jìn)一步對病理類型進(jìn)行判斷，將其余剩下的組織修剪成大小為 0.2 cm×0.2 cm×0.5 cm 的組織塊，使用生理鹽水對其反復(fù)沖洗3次以盡可能地去除殘留的糞質(zhì)及血凝塊，分塊后放入EP管內(nèi)轉(zhuǎn)入液氮罐中保存?zhèn)溆肹5]。PT-PCR對各標(biāo)本中NNMT mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行測量，首先利用Trizol法對組織中的總RNA進(jìn)行提取，隨后應(yīng)用紫外分光光度計(jì)法對定量RNA進(jìn)行測量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明對cDNA進(jìn)行合成，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在37 ℃的環(huán)境中進(jìn)行15 min的反應(yīng)，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)，反應(yīng)需要在5 ℃環(huán)境中進(jìn)行5 s。從基因GeneBank中查找出相關(guān)的引物序列進(jìn)行RT-PRC反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃環(huán)境中進(jìn)行預(yù)變形10 s，1 Cycle，PCR 反應(yīng)為 95 ℃，5 s，85 ℃，反應(yīng) 20 s，40 Cycle，融解曲線為 55 ℃，80 Cycle。PCR 產(chǎn)物的定性條件：取PCR的產(chǎn)物2 μl放置在2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，之后采用全自動凝膠成分分析系統(tǒng)對其拍照，將NNMT/β-actin比值×100作為NNMT mRNA的相對表達(dá)量。Westem-blot對上述各個標(biāo)本中的NNMT蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，具體操作：將組織剪碎后，向其加入細(xì)胞裂解液對其充分裂解，該裂解操作需要在冰上操作進(jìn)行；隨后進(jìn)行離心處理，離心速度為12 000 r/min，共離心15 min，提取血清后轉(zhuǎn)移到新管中，采用BCA法對NNMT蛋白含量進(jìn)行測量[6]。使用40 μg的蛋白質(zhì)作為上樣量，常規(guī)SDS聚丙烯酰胺凝膠實(shí)施封閉處理。將人NNMT多克隆抗體，小鼠抗人β-actin抗體作為一抗，將山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠作為二抗。ECL發(fā)光，X線膠片感光，將自動洗片機(jī)進(jìn)行洗片，檢測NNMT蛋白的表達(dá)水平，采用全自動凝膠成像系統(tǒng)測定各個組別的蛋白電泳積分光度值，NNMT/β-actin比值代表NNMT蛋白相對表白量[7]。

1.3 觀察指標(biāo)

對比NNMT mRNA及其蛋白在正常大腸黏膜組、大腸腺瘤組及大腸腺癌組組織中相對表達(dá)量，分析NNMT表達(dá)與大腸腺癌臨床病理因素的關(guān)系，對比不同NNMT表達(dá)情況下大腸腺癌患者短期生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達(dá)量對比

三組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大腸腺瘤組、大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量均高于正常大腸黏膜組，大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量均高于大腸腺瘤組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達(dá)量對比（±s）

表1 NNMT mRNA及其蛋白在各個組織中相對表達(dá)量對比（±s）

*與正常大腸黏膜組比較，P＜0.05；#與大腸腺瘤組比較，P＜0.05。

組別 NNMT mRNA NNMT 蛋白正常大腸黏膜組（n=50） 9.33±0.25 0.41±0.08大腸腺瘤組（n=50） 115.36±20.69* 0.65±0.06*大腸腺癌組（n=50） 992.25±84.25*# 0.89±0.05*#F值 12.254 10.987 P值 0.000 0.000

2.2 NNMT表達(dá)與大腸腺癌臨床病理因素的關(guān)系

不同NNMT表達(dá)情況大腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Dukes分期、組織學(xué)類型及浸潤深度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同NNMT表達(dá)情況大腸癌患者的組織學(xué)分級比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

表2 NNMT表達(dá)與大腸腺癌臨床病理因素的關(guān)系（例）

2.3 不同NNMT表達(dá)情況大腸腺癌患者短期生存期對比

大腸腺癌患者均接受為期3年的隨訪，NNMT陽性表達(dá)患者3年生存率為50.00%（14/28），低于NNMT陰性表達(dá)患者的90.91%（20/22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.475，P=0.002）。

3 討論

大腸腺癌作為臨床上一類較為常見的惡性腫瘤性疾病，近年來隨著社會的不斷發(fā)展，誘發(fā)因素的不斷增多，發(fā)病率也呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，同時據(jù)報(bào)道顯示，超過80%的大腸腺癌患者多由腺瘤性息肉不斷惡變及進(jìn)展而來[8]。也有臨床資料顯示，腫瘤的發(fā)生發(fā)展屬于一個比較復(fù)雜且變化較快的過程，實(shí)際上是由多種腫瘤的相關(guān)基因表達(dá)或抑癌基因失去活性所致[9]。因此，采取科學(xué)有效的指標(biāo)評價大腸腺瘤的發(fā)生發(fā)展及對大腸腺癌病情的影響具有重要的臨床意義。尋找并探討克隆相關(guān)基因是一個世界范圍的重要課題。既往臨床資料顯示，NNMT最早在1994年于肝臟組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種新型物質(zhì)，被證實(shí)與肝癌細(xì)胞的克隆與復(fù)制具有密切的相關(guān)性，隨后發(fā)現(xiàn)其基因位于11號染色體的短臂，其由三個外顯子及兩個內(nèi)含子構(gòu)成，因此所編碼的mRNA分子長度為952個核苷酸，分子量為29.6 KD[10-11]。在既往報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，NNMT與各類疾病間均具有密切的關(guān)系，不過這些研究進(jìn)行的帕金森與NNMT的分析相對較多。近年來，隨著對大腸腺癌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NNMT與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關(guān)性，同時發(fā)現(xiàn)NNMT在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，不過關(guān)于NNMT與甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制之間相關(guān)研究仍然較少[12]。隨后有研究開始就NNMT在大腸腺癌中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NNMT多在大腸腺癌的患者中以分泌型的形式存在，也被認(rèn)為是大腸腺癌的一種血清標(biāo)志物，但具體發(fā)病機(jī)制也仍值得分析與探討[13]。

在本次研究中，就NNMT在大腸腺瘤和大腸癌中的表達(dá)及與大腸腺癌的預(yù)后分析，結(jié)果顯示，三組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大腸腺瘤組、大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量均高于正常大腸黏膜組，大腸腺癌組NNMT mRNA及其蛋白表達(dá)量均高于大腸腺瘤組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NNMT mRNA在大腸腺癌患者中會表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨著大腸黏膜上皮細(xì)胞損害，腺瘤向著腺癌的進(jìn)展過程中也會開始出現(xiàn)NNMT表達(dá)水平升高的情況，由此也進(jìn)一步說明了NNMT的高表達(dá)會在腺瘤性息肉中存在，這也證實(shí)了NNMT的高表達(dá)可能是導(dǎo)致大腸腺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要的機(jī)制，也可被認(rèn)為是導(dǎo)致腺瘤向著腺癌轉(zhuǎn)化的作用，與既往研究報(bào)道基本一致[14]。同時，本研究就NNMT表達(dá)與大腸腺癌臨床病理因素的關(guān)系進(jìn)行分析，不同NNMT表達(dá)情況大腸癌患者的組織學(xué)分級情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大腸腺癌組織分級越低，細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制障礙程度較高，癌細(xì)胞增殖情況越強(qiáng)，病情越重，NNMT表達(dá)水平就越高，患者的預(yù)后表現(xiàn)也就越差[15]。另外，大腸腺癌患者均接受了為期3年的隨訪，NNMT陽性表達(dá)患者3年生存率為50.00%（14/28），低于NNMT陰性表達(dá)患者的90.91%（20/22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果可見，NNMT陽性表達(dá)患者的預(yù)后情況相對較差，證實(shí)了上述研究。不過由于本次研究樣本量較少，隨訪時間有限，在收集數(shù)據(jù)上可能存在缺陷，在接下來的研究中可深入分析。

綜上所述，NNMT在大腸腺瘤與大腸腺癌組織中的表達(dá)存在明顯的差異性，NNMT陽性表達(dá)患者的短期生存率較低。