羧甲基化棉短絨止血紗布的生物相容性研究

柳小軍 劉康博 劉振 師月 周靜 徐玉茵 王海濤 田源

0 引言

突發(fā)事故、戰(zhàn)爭(zhēng)和外科手術(shù)中的創(chuàng)傷出血難以避免，這極大地危及傷者的生命安全，而且大量失血也正是傷者死亡主要原因之一?？焖儆行У闹寡侄文芴岣叽婊盥剩瑴p少傷者術(shù)后出現(xiàn)的并發(fā)癥。及時(shí)有效的止血成為了緊急救治過程中的關(guān)鍵步驟。外科手術(shù)是控制創(chuàng)面出血的主要方法之一，而使用止血材料止血是臨床中常見的輔助止血手段，目前常用的主要有醫(yī)用脫脂棉紗布和各種生物醫(yī)用止血材料。醫(yī)用脫脂棉紗布因具有吸水能力強(qiáng)以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，一直是醫(yī)院及家庭在創(chuàng)傷出血急救時(shí)常用的止血材料[1-3]，然而由于其在使用過程中容易粘連創(chuàng)面周圍的組織器官，在移除時(shí)也較容易出現(xiàn)創(chuàng)面再出血和二次創(chuàng)傷[4-5]，顯著地降低了止血效果，進(jìn)而影響手術(shù)質(zhì)量和預(yù)后效果。因此，近年來生物醫(yī)用止血材料在臨床中的應(yīng)用日益廣泛。

醫(yī)用可吸收止血紗布是由天然或再生纖維素經(jīng)改性而制得的一類具有良好吸水性能的纖維素衍生物。這類止血材料因原料來源廣泛、價(jià)格較低、可吸收和止血效果好等優(yōu)點(diǎn)成為了在臨床上應(yīng)用較多的止血產(chǎn)品之一[6-10]。目前臨床上這類止血材料仍以進(jìn)口為主，雖效果較好，但價(jià)格昂貴；而國(guó)內(nèi)的同類產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[11]。因此，開發(fā)具有良好生物相容性且止血效果好的生物醫(yī)用止血材料十分重要。

棉短絨屬于天然纖維，纖維長(zhǎng)度短，并且廉價(jià)易得，使用后易降解。目前，棉短絨及其改性制品在清理水或油污染方面受到廣泛關(guān)注[12-13]，然而將其用于止血紗布的制備尚未見報(bào)道。前期研究以棉短絨紗布為原料，通過化學(xué)改性制備了羧甲基化棉短絨止血紗布。棉短絨雖具有良好的生物相容性，但其經(jīng)羧甲基化改性后的成分和結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變，其生物相容性也可能發(fā)生了改變，而且根據(jù)現(xiàn)行的《醫(yī)療器械分類目錄》要求，羧甲基化棉短絨止血紗布作為植入類醫(yī)療器械應(yīng)按照第三類醫(yī)療器械進(jìn)行管理。在臨床應(yīng)用過程中，需接觸人體組織和血液，因此它不僅應(yīng)無毒、無刺激性和無致敏性，還應(yīng)對(duì)機(jī)體的組織和血液等系統(tǒng)無不良作用。因此，重新評(píng)估其生物相容性是很有必要的。本研究參考GB 16886.1—2011要求，選取了皮內(nèi)反應(yīng)、皮膚致敏、急性全身毒性、溶血、體外凝血指標(biāo)和和體外血栓形成等試驗(yàn)，通過體內(nèi)和體外兩種不同的途徑初步進(jìn)行生物相容性研究，探討其生物安全性，進(jìn)而分析其在創(chuàng)面止血過程中可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)，旨在為臨床中該生物醫(yī)用止血材料的安全應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)方案

1.1 主要材料與試劑

羧甲基化棉短絨止血紗布(實(shí)驗(yàn)組)；可吸收止血紗布(對(duì)照組，規(guī)格100 mm×75 mm，批號(hào)19111559，惠州華陽醫(yī)療器械有限公司)；弗氏完全佐劑(SLCF1289，Sigma公司)；生理鹽水(C2191123C3，河南科倫藥業(yè)有限公司)；植物油(20210102，江西益普生藥業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本大耳白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，健康白化豚鼠，體質(zhì)量300～350 g，均購(gòu)于北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司[許可證號(hào)SCXK(京)2020-0002]。SPF級(jí)KM小鼠，雌鼠無孕，體質(zhì)量17～23 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(豫)2017-0001]。

1.3 生物相容性檢測(cè)

(1) 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)：取羧甲基化棉短絨止血紗布，制備生理鹽水浸提液和植物油浸提液，浸提比例為1.25 cm2/mL，置于37℃恒溫箱中振蕩72 h。陰性對(duì)照組為生理鹽水和植物油。依據(jù)GB/T 16886.10—2017中規(guī)定的方法試驗(yàn)，取健康兔子3只，分別注射兩種浸提液和浸提介質(zhì)，并觀察記錄24 h、48 h和72 h各注射部位狀況，按表1記錄各注射點(diǎn)的紅斑和水腫反應(yīng)的記分結(jié)果，得出皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)的最終記分。

表1 皮內(nèi)反應(yīng)記分標(biāo)準(zhǔn)

(2) 皮膚致敏試驗(yàn)：取羧甲基化棉短絨止血紗布，分別制備生理鹽水浸提液和植物油浸提液，浸提比例為1.25 cm2/mL，置于37 ℃恒溫箱中振蕩72 h。陰性對(duì)照組為生理鹽水和植物油。依據(jù)GB/T 16886.10—2017中規(guī)定的最大劑量法試驗(yàn)，并按照Magnusson和Kligman分級(jí)，對(duì)皮膚的紅斑和水腫情況進(jìn)行雙盲分級(jí)，得到皮膚致敏反應(yīng)的平均等級(jí)。

(3) 急性毒性反應(yīng)試驗(yàn)：取羧甲基化棉短絨止血紗布，制備生理鹽水浸提液和植物油浸提液，浸提比例為1.25 cm2/mL，置于37 ℃恒溫箱中振蕩72 h。陰性對(duì)照組為生理鹽水和植物油。依據(jù)GB/T 16886.11—2011和GB/T 14233.2—2005中規(guī)定的方法試驗(yàn)，自腹腔分別注射兩種浸提液和浸提介質(zhì)。注射完畢后，觀察小鼠即時(shí)反應(yīng)，并在4 h、24 h、48 h和72 h按表2觀察和記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)，并稱量動(dòng)物體質(zhì)量。

表2 毒性反應(yīng)觀察

(4) 溶血試驗(yàn)：依據(jù)GB/T 16886.4—2003中規(guī)定的方法試驗(yàn)，首先制得新鮮抗凝兔血的稀釋溶液。在實(shí)驗(yàn)組試管中加入10 mL生理鹽水和12.5 cm2羧甲基化棉短絨止血紗布。在陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組試管中分別加入10 mL的生理鹽水和純化水。所有試管在37 ℃恒溫箱中放置30 min，分別加入抗凝兔血的稀釋溶液0.2 mL，混勻后保溫60 min。移出管內(nèi)液體，離心取上清，用分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。取三組平行，計(jì)算出各組平均值。按下式得出溶血率。

(1)

式中：OD545a為實(shí)驗(yàn)組光密度平均值；OD570b為陰性對(duì)照組光密度平均值；OD570c為陽性對(duì)照組光密度平均值。

(5) 體外凝血指標(biāo)試驗(yàn)：依據(jù)凝血瀑布機(jī)制，凝血過程分為外源性凝血途徑、內(nèi)源性凝血途徑以及共同凝血途徑[14]。一般認(rèn)為凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)是評(píng)價(jià)內(nèi)源性凝血途徑的一種有效方法；活化部分凝血酶原時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)則可作為外源性途徑及共同途徑凝血因子的定量實(shí)驗(yàn)；纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)用于測(cè)定血漿中纖維蛋白原的含量[15]。分別取20 mg實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組紗布，置于3 mL的硅化玻璃采血管中，依此制備5個(gè)重復(fù)樣。選取健康家兔，心臟取血，新鮮兔血與3.8 %枸櫞酸鈉溶液以9∶1(體積比)比例混合。將新鮮抗凝全血以3000 r/min離心15 min，取1 mL上層貧血小板血漿分別加入到每個(gè)硅化玻璃采血管中，使血漿浸沒樣品，放置于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱內(nèi)。在37 ℃條件下，30 r/min動(dòng)態(tài)接觸30 min。吸取上層血漿，采用全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間和纖維蛋白原?？瞻捉M為純血漿。

(6) 體外血栓形成試驗(yàn)：采用纖維蛋白原體外血栓形成法[16-17]。該方法基于在血液凝固關(guān)鍵過程中纖維蛋白原會(huì)在凝血酶作用下轉(zhuǎn)化為不溶的纖維蛋白并交聯(lián)形成血栓，通過測(cè)量血漿纖維蛋白原水平可以反映血栓形成中血液凝固的程度[18]。取0.5 cm2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組紗布分別制備5個(gè)重復(fù)樣放置于硅化玻璃管中。取3.8%枸櫞酸鈉溶液(體積比1∶0.04)新鮮抗凝兔血20 mL。向?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組中每個(gè)硅化玻璃管交叉加入1.0 mL血液。在空白組硅化玻璃管中加入1.0 mL血液。在室溫下，靜置15 min后，向各管中加入10 μL 的6250 U/mL肝素鈉(加入順序同上述加血液順序)。各管充分震蕩混勻后，室溫靜置30 min。吸取各管中的血液，2000g離心10 min后取上層血漿，在凝血分析儀上檢測(cè)纖維蛋白原水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Graphpad prism 7 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，3 組及以上統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用one-way ANOVA 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

分別在24 h、48 h和72 h內(nèi)對(duì)每只兔子的皮膚進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的動(dòng)物皮膚注射處均未見有明顯的異常反應(yīng)，兩組的最終記分均為0。結(jié)果表明，羧甲基化棉短絨止血紗布無刺激性。

2.2 皮膚致敏試驗(yàn)結(jié)果

在24 h和48 h觀察期，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組激發(fā)處理部位的皮膚均未見有明顯異常反應(yīng)。根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的動(dòng)物平均等級(jí)均為0級(jí)。結(jié)果表明，羧甲基化棉短絨止血紗布無皮膚致敏性。

2.3 急性全身毒性反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，而且在72 h觀察期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，未觀察到有明顯的運(yùn)動(dòng)減少、步態(tài)不穩(wěn)、呼吸困難、腹瀉、震顫和死亡等異常情況。結(jié)果表明，羧甲基化棉短絨止血紗布無急性全身毒性反應(yīng)。

表3 急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 溶血性能

陽性對(duì)照組的吸光度在0.8±0.3范圍(0.8843)內(nèi)，陰性對(duì)照組的吸光度小于0.03(0.0084)，實(shí)驗(yàn)組的溶血率為1.8%。試驗(yàn)結(jié)果符合小于5%的安全標(biāo)準(zhǔn)要求。在試驗(yàn)中也觀察到，離心后陽性對(duì)照組的溶液呈鮮紅色，紅細(xì)胞破裂現(xiàn)象較為明顯；而實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組紅細(xì)胞沉在底部，溶液呈澄清透明，未見有明顯的紅細(xì)胞破裂現(xiàn)象。

2.5 體外凝血指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果分析

三組之間的PT沒有顯著差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組的APTT值顯著大于空白組(P<0.05)，同時(shí)顯著小于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Fbg值均顯著大于空白組(P<0.05)，而彼此之間無顯著性差異(P>0.05)，如圖1所示。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的PT和Fbg值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而兩組的APTT值雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是相對(duì)百分比為92.4%，在醫(yī)療器械要求的85%～115%允許范圍內(nèi)。

圖1 紗布的體外凝血指標(biāo)

2.6 體外血栓形成試驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的纖維蛋白原含量具有顯著性差異(P<0.05)，并且兩組含量均顯著小于空白組P<0.05)，如圖2所示。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的纖維蛋白原含量雖然與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩組的相對(duì)百分比為94.6%，在醫(yī)療器械要求的85%～115%允許范圍內(nèi)。

圖2 體外血栓形成試驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

理想的可吸收止血材料應(yīng)來源充足，易于裁剪和保存，降解能力強(qiáng)，具有較好的止血性能。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，通過羧甲基化改性棉短絨紗布制備出羧甲基化棉短絨止血紗布。該止血紗布不僅應(yīng)有良好的理化性能，同時(shí)還應(yīng)具有良好的生物相容性。

依據(jù)GB 16886.1—2011，皮膚刺激和致敏性是對(duì)醫(yī)療器械或材料生物相容性研究的必測(cè)項(xiàng)目。對(duì)機(jī)體來說，植入類的醫(yī)療器械或材料都是外來異物，均可能會(huì)引起機(jī)體的刺激作用和免疫應(yīng)答，進(jìn)而發(fā)生刺激和超敏反應(yīng)。急性全身毒性試驗(yàn)是指在一次或多次大劑量給藥后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的身體狀態(tài)和體質(zhì)量變化等指標(biāo)，評(píng)價(jià)醫(yī)療器械或材料是否有急性全身毒性反應(yīng)。常用的給藥方式有腹腔注射、尾靜脈注射和經(jīng)口灌胃等。有學(xué)者認(rèn)為在標(biāo)準(zhǔn)濃度下這幾種給藥方式的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[19]，但尾靜脈注射的給藥方式具有起效快的優(yōu)點(diǎn)[20]。然而因羧甲基化棉短絨止血紗布因具有凝血作用，尾靜脈注射的給藥方式并不適用。再結(jié)合羧甲基化棉短絨止血紗布的使用部位，經(jīng)口灌胃的給藥方式也不適用。因此，本試驗(yàn)采用腹腔注射的給藥方式，并且選用極性浸提介質(zhì)生理鹽水和非極性浸提介質(zhì)植物油。這更能夠較全面體現(xiàn)羧甲基化棉短絨止血紗布對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性全身毒性反應(yīng)。

當(dāng)醫(yī)療器械或材料植入機(jī)體后，會(huì)與機(jī)體中的血液接觸并發(fā)生血液反應(yīng)。體外血液相容性正是在體外環(huán)境下檢測(cè)醫(yī)療器械或材料與血液接觸時(shí)對(duì)血液的影響，主要有溶血率、體外凝血指標(biāo)和體外血栓形成指標(biāo)等。其中溶血試驗(yàn)?zāi)軌蜉^敏感地反映醫(yī)療器械或材料對(duì)血液中紅細(xì)胞的影響，通過測(cè)定器械或材料與血液中血細(xì)胞在接觸過程中紅細(xì)胞的溶解和血紅蛋白的游離程度來評(píng)價(jià)其在體外環(huán)境下的急性溶血活性[21]。體外凝血指標(biāo)是體外血液相容性的重要內(nèi)容。臨床檢測(cè)中PT、APTT和Fbg較為敏感[16]，因此這三項(xiàng)已被廣泛地應(yīng)用于血液相容性的研究。體外血栓形成試驗(yàn)則是測(cè)試了血栓形成中血液凝固的程度。

綜上所述，本研究通過對(duì)羧甲基化棉短絨止血紗布進(jìn)行生物相容性研究，表明該止血紗布具有良好的生物安全性，為其在臨床創(chuàng)面止血中的安全應(yīng)用提供了可靠保障。