3D打印多孔β-TCP負載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架的表征評價

王建 范江偉 陳洪濤

0 引言

感染性骨缺損主要是由于早期不恰當?shù)那鍎?chuàng)或固定導致傷口裂開，繼而引發(fā)感染形成的并發(fā)癥[1]。傳統(tǒng)的治療途徑包括植骨、Ilizarov 技術(shù)、Masquelet誘導膜技術(shù)及抗生素治療等，雖然有一定的修復(fù)效果，但仍難以滿足臨床治療。目前最大的難點是缺少一種既具備抗感染能力又能填補骨缺損的骨組織替代材料[2]。隨著數(shù)字醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，3D打印骨組織工程支架負載局部藥物緩釋系統(tǒng)為治療感染性骨缺損提供了一種新的途徑[3]。

磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)主要是由鈣、磷組成，其成分與骨基質(zhì)的無機成分相似，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)的不同可分為高溫型α-TCP 和低溫型β-TCP[4]。β-TCP具有良好的生物活性和降解性，動物或人體細胞可以在β-TCP材料上正常生長、分化和繁殖，是理想的人體硬組織替代材料[5]。萬古霉素(vancomycin，VAN)是糖肽類窄譜抗生素，主要通過干擾細菌細胞壁結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組分肽聚糖來干擾細胞壁的合成，抑制細胞壁中磷脂和多肽的生成，也可能改變細菌細胞膜的滲透性，對葡萄球菌屬中甲氧西林敏感及耐藥株有良好的抗菌作用[6-7]。因此將VAN包埋于緩釋載體制成緩釋微球后進行局部給藥，不僅能發(fā)揮其抗菌作用，而且還能避免許多不良反應(yīng)。對于緩釋載體的研究，近年來已經(jīng)有大量的天然或人造材料被廣泛應(yīng)用于緩釋微球的制備，天然材料如藻酸鹽、膠原、纖維素和明膠，人造材料如聚乳酸、聚乙醇酸及兩者的共聚物聚乳酸-羥基乙酸(poly lactic co glycolic acid，PLGA)[8]。PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，同時也是人代謝途徑的副產(chǎn)物，所以當它應(yīng)用在醫(yī)藥和生物材料中時不會有毒副作用，可以用來充當藥物緩釋載體[9]。目前，PLGA作為藥物緩釋載體的制備方法有乳化溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、膜乳化法以及微流體法，乳化溶劑揮發(fā)法因簡易的操作流程和相對精簡的儀器設(shè)備成為制備微球最常用的方法[10]。

基于此，本研究通過 3D 打印工藝，以β-TCP為基礎(chǔ)材料，構(gòu)建立體網(wǎng)格狀支架。以復(fù)乳法制備VAN/PLGA 緩釋微球，并用殼聚糖包被靜電吸附法將緩釋微球負載于3D 打印多孔β-TCP支架，構(gòu)建既有骨修復(fù)作用又有抗菌作用的復(fù)合支架，并對支架進行表征評價，觀察其緩釋性能、力學性能和抗感染修復(fù)功能，初步評價其作為修復(fù)骨缺損材料的可行性，以期為感染性骨缺損的治療尋找一種全新的治療方法。

1 材料及方法

1.1 實驗試劑及儀器

PLGA(購自Sigma公司)；VAN(購自浙江醫(yī)藥股份有限公司)；β-TCP(購自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)；殼聚糖、聚乙烯醇(均購自北京有機化學廠)；二氯甲烷(購自西安化學試劑廠)；3D噴墨打印機(購自德國Envision TEC公司)；掃描電鏡(購自日本Jeol公司)；紫外分光光度儀(購自美國HP公司)；醫(yī)用離心機(購自北京醫(yī)用離心機廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 3D打印多孔β-TCP負載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架的構(gòu)建

(1) 3D打印多孔β-TCP支架：利用CAD軟件繪制多孔β-TCP支架，將β-TCP粉與6% PVA黏結(jié)劑按5∶3的比例混合為打印墨水，用3D打印機打印，打印完畢后在室溫下干燥，并在馬弗爐中燒結(jié)成質(zhì)地堅硬的β-TCP骨組織工程支架。

(2) VAN/PLGA緩釋微球制備：采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法(W/O/W)制備緩釋微球，將0.3 g/mL的VAN水溶液與44.5 mg/L的PLGA二氯甲烷溶液按1∶9混合后進行超聲乳化，形成穩(wěn)定的乳白色初乳；并將初乳按1∶4的比例逐滴快速加入2%PVA溶液中，不斷攪拌使得有機溶劑快速蒸發(fā)，靜置后收集沉淀，用純凈水洗滌、離心、真空凍干得緩釋微球。

(3) 復(fù)合支架構(gòu)建：將上述制成的β-TCP骨支架用1%冰醋酸溶液配制的2%殼聚糖溶液浸泡，待完全浸濕后取出，放置在 37 ℃烘箱烘干。此操作重復(fù) 3 遍，使β-TCP空白支架包被一層帶正電荷的殼聚糖，將此殼聚糖包被過的支架放入離心管內(nèi)，同時滴入帶負電荷的 VAN/PLGA 緩釋微球蒸餾水懸液，輕微震蕩混勻10 min，使微球均勻吸附填充于支架孔隙內(nèi)，1000 r/min離心5 min，取出材料凍干；再將此負載有微球的支架浸泡入殼聚糖溶液中，待完全浸濕浸透后，取出凍干即得復(fù)合支架。

1.2.2 VAN/PLGA微球β-TCP復(fù)合支架的表征評價

(1) 形態(tài)學觀察：肉眼觀察復(fù)合支架的形態(tài)及大小，在支架表面進行噴金處理后，通過電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

(2) 孔隙率測定：采用置換法測孔隙率。在潔凈干燥的比重瓶中裝滿乙醇，稱重為W1，將質(zhì)量為W0的復(fù)合支架浸入乙醇中，超聲除氣，使得支架孔隙充滿乙醇，再向比重瓶中補滿乙醇，稱重為W2，取出支架，剩余比重瓶稱重為W3，測得當前溫度下乙醇密度為ρ0。孔隙率 (Φ，% ) =[(W2-W3-W0)/ρ0]/[(W1-W3)/ρ0]×100%。

(3) 載藥率、包封率的測定：取2 mg干燥VAN緩釋微球置于10 mL試管，加入二氯甲烷1 mL超聲振蕩溶解，加入PBS液4 mL快速混勻，靜置10 min，1000 r/min 離心5 min，取上清采用紫外分光光度儀測量260 nm處吸光度，重復(fù)3次取均值，繪制VAN標準曲線，計算微球載藥率和包封率。載藥率=微球中藥物質(zhì)量/微球總質(zhì)量；包封率=微球中藥物總質(zhì)量/投入藥物總質(zhì)量。

(4) 藥物緩釋率測定：稱取一定量的復(fù)合支架置于離心管中，加入1 mL二氯甲烷溶解完全，再加入4 mL PBS溶液，離心取上清，測260 nm處吸光度，根據(jù)標曲計算復(fù)合支架中VAN總含量。再稱取等量的緩釋微球和復(fù)合支架，分別加入5 mL PBS溶液，密封置于 37℃恒溫震蕩箱中孵育，每間隔2 d收集0.5 mL PBS溶液并用原有PBS補足至原來體積，樣品離心后取上清液，測260 nm 處測吸光度，根據(jù)標曲計算出藥物釋放量，每個實驗重復(fù)3次，平均值用來計算釋放率，釋放率=藥物釋放量/支架中總藥物量×100%。

(5) 力學性能測定：分別取3個β-TCP空白支架和β-TCP負載VAN/PLGA復(fù)合支架，應(yīng)用萬能材料力學試驗機比較其力學性能，通過最大負荷和最大強度來衡量性能好壞。

(6) 體外降解實驗：配置模擬體液(simulated body fluids,SBF)，分別取β-TCP空白支架和β-TCP負載VAN/PLGA微球復(fù)合支架樣本，稱重后浸入100 m L SBF溶液中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每周換液，并取出樣品真空干燥后稱重，記錄其質(zhì)量，待復(fù)合支架完全降解后，以降解時間為橫坐標、質(zhì)量為縱坐標繪制變化曲線圖。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學

3D打印多孔β-TCP支架外觀如圖1所示。支架呈白色立方體狀(A)，表觀體積為6 mm×6 mm×5 mm，在光鏡下放大10倍后可見支架表面有許多排列整齊、大小均一的孔隙(B)。

圖1 3D打印 β-TCP支架形態(tài)

β-TCP負載VAN/PLGA微球復(fù)合支架形態(tài)學觀察見圖2。由于3D打印的β-TCP支架外包被了一層帶正電荷的殼聚糖，它能與帶負電荷的VAN/PLGA微球互相吸附，使得支架表面和內(nèi)部空隙均勻地覆蓋了緩釋微球(A)；取其斷面在光學顯微鏡下放大10倍后就可清楚地看見β-TCP支架上分布著一層大小均勻的圓形顆粒(B)；將其在掃描電鏡下放大300倍后就能看到 β-TCP負載VAN/PLGA微球復(fù)合支架的內(nèi)部形態(tài)(B)。

圖2 β-TCP負載VAN/PLGA微球復(fù)合支架形態(tài)學觀察

2.2 孔隙率

通過液體置換法測量了β-TCP空白支架和β-TCP負載VAN/PLGA復(fù)合支架的平均孔隙率分別為(65.27±2.37)%和(55.39±1.76)%，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.552，P=0.032)。

2.3 藥物緩釋率

精密稱取一定量的VAN用PBS溶解，配置成濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的溶液，分別測量其260 nm處的吸光度(A)，以VAN濃度為橫坐標，A為縱坐標繪制標準曲線(圖3)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)VAN 標準曲線測得VAN/PLGA微球?qū)AN的藥物負載率為(17.42±1.85)%，包封率為(35.13±3.59)%。

圖3 VAN標準曲線

體外藥物釋放實驗結(jié)果顯示，VAN微球的釋放率遠高于β-TCP負載VAN/PLGA復(fù)合支架的釋放率，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著時間的延長，由于殼聚糖對復(fù)合支架的包被逐漸減弱，釋放率也隨之增加，在24 d時VAN微球釋放率達80%，復(fù)合支架釋放率達50%，還可以繼續(xù)釋放，在體內(nèi)維持長時間的抑菌效果，見圖4。

圖4 藥物累積釋放曲線

2.4 復(fù)合支架力學性能

力學性能結(jié)果表明，3D打印β-TCP支架最大負荷為(107.83±7.81)N，最大強度為(3.02±0.21)MPa；β-TCP負載VAN/PLGA復(fù)合支架最大負荷為(174.50±7.80)N，最大強度為(4.83±0.25)MPa，與空白支架相比差異均有統(tǒng)計學意義(t=10.462，t=9.901，P<0.001)。

2.5 體外降解實驗

體外降解實驗可以看出，β-TCP空白支架和復(fù)合支架在SBF模擬液中均逐漸降解，早期降解速度較慢，隨時間的延長降解速度也隨之加快，在14周時β-TCP空白支架已降解完全，而負載VAN/PLGA復(fù)合β-TCP支架第20周時才能徹底降解，見圖4。

圖4 體外降解曲線

3 討論

3D打印技術(shù)在多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是在醫(yī)療方面有較高的應(yīng)用價值，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、牙齒等的3D打印[11]。TCP作為日常鈣源之一，相比其他補鈣產(chǎn)品，其優(yōu)勢在于可同時提供鈣和磷，鈣和磷兩種礦物質(zhì)是骨骼形成的必需物質(zhì)，在體內(nèi)維持平衡非常重要[12]。大量實驗研究已證實β-TCP 雖然可在骨骼接合界面產(chǎn)生分解、吸收和析出等反應(yīng)，實現(xiàn)牢固結(jié)合，但其材質(zhì)比較脆，柔韌性能差，力學承受能力也較低，不容易塑型[13]。另有研究表明，PLGA包埋微球在體內(nèi)釋放時，可形成一種偏酸的液體環(huán)境，破壞體內(nèi)平衡，選取一種堿性物質(zhì)與其中和，則能有效維持體內(nèi)酸堿度平衡[14]。而殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰反應(yīng)后的產(chǎn)品，它作為一種天然高分子材料，具有良好的血液相容性、安全性和微生物降解等優(yōu)良性能，將β-TCP與殼聚糖復(fù)合后，可以調(diào)節(jié)支架機械強度、機械效率，滿足組織力學和生理需要[15]。

β-TCP負載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架能否用于臨床上治療感染性骨缺損需要多方面的考察。研究表明，由于3D打印支架多孔的存在，使得該支架的表面積較傳統(tǒng)支架大大增加，明顯提高了載藥量和緩釋時間，能夠長時間起到骨修復(fù)作用[16]。還有研究證實，將β-TCP支架與VAN/PLGA微球結(jié)合后，相對于空白的β-TCP支架，復(fù)合支架承受的機械強度明顯增大，抗壓強度從2.90 MPa升高到4.19 MPa，韌性從0.17 MPa升高到1.44 MPa，改善了其力學性能的同時仍保持良好的生物活性和降解性能[17]。除了對復(fù)合支架載藥量、緩釋率及力學性能等的表征評價外，體內(nèi)外實驗研究也是對復(fù)合支架骨修復(fù)能力評估的重要指標。韓倩倩等[18]研究表明3D打印β-TCP復(fù)合淫羊藿苷支架植入股骨頭壞死模型兔體內(nèi)，可促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞活性，同時促進新生血管生成，具有促進兔股骨頭壞死修復(fù)的作用。Samaszko-Fiertek等[19]將萬古霉素殼聚糖緩釋液加到培養(yǎng)金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基中，每隔24h測量抑菌圈大小，結(jié)果顯示萬古霉素殼聚糖緩釋微球可以抑制金黃色葡萄球菌的增長。

本實驗選用殼聚糖溶液去包被β-TCP支架，使支架表面附著一層帶正電荷的薄膜，該薄膜能與帶負電荷的VAN/PLGA微球互相吸引，形成一種具有抗感染功能的復(fù)合支架。同時，殼聚糖是一種堿性多糖聚合物，可在弱酸環(huán)境下溶解并產(chǎn)生堿性物質(zhì)，能中和PLGA釋放的酸性物質(zhì)，維持體內(nèi)酸堿度平衡。本實驗中3D打印多孔β-TCP負載VAN/PLGA微球復(fù)合支架與β-TCP空白支架比較，孔隙率有所下降，其原因可能是空白支架孔隙中吸附了緩釋微球；復(fù)合支架最大負荷和最大強度均有所提升，主要原因是β-TCP與殼聚糖復(fù)合能增強支架韌性和強度，與文獻報道相吻合。此外，負載VAN/PLGA微球的復(fù)合β-TCP支架體外降解時間有所延長，并且在早期階段降解速度比空白β-TCP支架緩慢，提示殼聚糖包被VAN/PLGA膠囊能減緩釋藥物釋放速率，延長藥物在體內(nèi)的降解時間，減少機體因藥物不耐受而引起的不良反應(yīng)，長時間起到抗菌修復(fù)作用。

4 結(jié)論

3D打印技術(shù)制作的多孔β-TCP負載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架具有良好的緩釋性能、力學性能和抗感染修復(fù)功能，能作為修復(fù)骨缺損的優(yōu)良材料。后期將對該復(fù)合支架進行體內(nèi)實驗(新西蘭兔)，觀察復(fù)合支架體內(nèi)局部抗感染效果、骨缺損修復(fù)能力，同時也為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，最終為感染性骨缺損的治療尋找一種全新的治療方法。