慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能及篩板形態(tài)改變

張景茜 任璐頔 錢秀清，2

0 引言

青光眼作為不可逆致盲眼病之一，現(xiàn)已影響全球超過7 000萬人，且患病人數(shù)逐年上升，有研究預(yù)計，到2040年全球患青光眼患者比例為3.54%，患病人數(shù)將上升至1.1億[1]。目前青光眼的發(fā)病機制尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)病理性眼壓升高是青光眼發(fā)病的重要影響因素。建立慢性高眼壓動物模型是研究青光眼發(fā)病機制的主要手段之一，常用的實驗動物包括猴、兔、鼠等[2-3]，由于鼠與靈長類動物角膜緣有相似的解剖結(jié)構(gòu)，且其眼壓升高后能產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞變性、視神經(jīng)纖維丟失等與人眼青光眼相似的病理變化[4]，除此外還有操作方便、成本較低等優(yōu)勢，因此應(yīng)用廣泛。

慢性高眼壓的作用會影響視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的光學(xué)功能[5-8]，視覺電生理技術(shù)可以檢測視網(wǎng)膜和視神經(jīng)功能學(xué)的改變。視神經(jīng)發(fā)源于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞層，神經(jīng)節(jié)細胞軸突延伸到視神經(jīng)乳頭處，穿出篩板從而形成有髓視神經(jīng)。視網(wǎng)膜在受到圖形或者光的刺激之后，光感受器細胞內(nèi)會引起光化學(xué)反應(yīng)和光電反應(yīng)，產(chǎn)生電位改變并形成神經(jīng)沖動，視覺電生理技術(shù)可對這種電位變化進行記錄與處理[9]，并無創(chuàng)、客觀地對視功能進行檢測與評估。視覺電生理技術(shù)主要包括閃光視網(wǎng)膜電圖(flash electroretinogram，F(xiàn)-ERG)、閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP)等[10-11]。目前，有大量研究通過對慢性高眼壓模型進行視覺電生理的測試，獲取慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能學(xué)的損傷規(guī)律。有研究發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓模型建立3周后，F(xiàn)-ERG的a波振幅顯著下降，而b波與振蕩電位(oscillatory potential，OP)波的振幅較為敏感，于建模后1周就出現(xiàn)下降情況。此外，VEP的潛伏期在建模2周后顯著延長，同時其振幅顯著下降[5-7]。慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能學(xué)的損傷可能發(fā)生在造模后1～3周之間，且損傷隨著高眼壓作用時間的延長而呈現(xiàn)進行性趨勢。

視網(wǎng)膜功能學(xué)的改變可能與視神經(jīng)穿過篩板時受到的擠壓作用有關(guān)。視神經(jīng)軸突通過篩孔穿出眼球，研究發(fā)現(xiàn)眼壓升高會導(dǎo)致篩板變形，從而擠壓視神經(jīng)，影響視神經(jīng)中的軸漿運輸和視神經(jīng)功能學(xué)的改變[12-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，眼壓升高會導(dǎo)致篩板微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如部分篩孔形狀從圓形變?yōu)闄E圓形[15-16]。篩板微結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致視神經(jīng)軸突的損傷，有研究在誘導(dǎo)高眼壓模型后，在電鏡下觀察到視神經(jīng)軸突嚴重損傷且軸突密度顯著下降[3]。因此，研究高眼壓作用下篩板微結(jié)構(gòu)的改變對青光眼致病機制的研究有重要意義。

本研究通過烙閉鞏膜上靜脈結(jié)合球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶以獲得慢性高眼壓大鼠模型，對其進行眼壓監(jiān)測，綜合考慮慢性高眼壓作用下視覺電生理與形態(tài)學(xué)的改變，選擇慢性高眼壓造模后2周和4周作為時間觀察點；對大鼠進行視覺電生理測量，通過激光共聚焦顯微鏡觀察篩板組織圖像，并計算篩板組織孔隙率。最終得到鼠眼的視網(wǎng)膜功能和篩板形態(tài)隨著高眼壓持續(xù)作用的變化規(guī)律，為青光眼致病機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康、雄性成年SD大鼠，體重介于300～450 g，雙眼角膜狀況良好、眼底正常、屈光間質(zhì)清，且無其他全身疾病。本實驗采取自身對照方案，左眼作為對照組，右眼為實驗組。實驗動物由首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供，在溫度和濕度適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)，保證晝夜12 h交替，并提供標準的水和食物。實驗遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會頒發(fā)的《實驗動物管理條例》，并嚴格按照國際眼科和視覺科學(xué)研究中動物實驗的 ARVO 聲明進行處理。

1.2 眼壓測量

分別對處在清醒狀態(tài)下的正常大鼠和造模前、造模后2 d以及造模后每周的慢性高眼壓模型大鼠進行眼壓測量，保證在每日同一時段內(nèi)(15∶00-16∶30)由專人使用TonoLab眼壓筆(iCare，芬蘭)進行測量工作。眼壓筆在測量時應(yīng)保證筆頭垂直且輕觸在鼠眼角膜中央處，勿過度用力，選取3次有效測量值的平均值作為該眼的最終眼壓值。

1.3 慢性高眼壓模型建立

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行全身麻醉后，烙閉鞏膜上靜脈，然后在球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。左眼作為對照眼，不作處理。之前的研究已經(jīng)證明造模使用的藥物氟尿嘧啶對眼壓沒有影響[17]，因此本次實驗沒有建立藥物對照組。

1.4 閃光視網(wǎng)膜電圖測量

分別對正常大鼠和造模后2周、4周大鼠各6只用Espion E3視覺電生理儀(Diagnosys，美國)進行閃光視網(wǎng)膜電圖的測量。

實驗前對大鼠進行完全暗適應(yīng)(時間定為2 h)，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行全身麻醉，右眼滴入散瞳滴眼液(日本參天制藥有限公司)并散瞳20 min。記錄電極為環(huán)狀電極，分別置于雙眼眼角鞏膜緣；參考電極為針狀電極，置于大鼠鼻內(nèi)；接地電極平行于身體置于尾部。實驗使用全視野刺激器，按照國際臨床視覺電生理學(xué)會標準化方案順序記錄視桿反應(yīng)、最大混合反應(yīng)、振蕩電位，明適應(yīng)10 min后記錄視錐反應(yīng)及閃爍光反應(yīng)(30 Hz)。

閃光視網(wǎng)膜電圖的典型波形如圖1所示，a波是一個負相波，起源于感光細胞的內(nèi)段，其振幅的變化主要反映視網(wǎng)膜感光細胞層功能變化；b波是ERG中的正相成分，它起源于視網(wǎng)膜的內(nèi)核層，其振幅的變化可反映視網(wǎng)膜第二級神經(jīng)元和放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞的功能變化；OP由一組小波組成，它們重疊出現(xiàn)在 b波的上升支上，反映內(nèi)核層至內(nèi)叢狀層功能。由于OP2子波受a波幅值影響較小，幅值較高，波形穩(wěn)定，故以O(shè)P2作為OP 參數(shù)中的重要指標之一。本實驗主要觀察指標包括：Rod-ERG的b波潛時、幅值；Max-ERG的a、b波潛時、幅值；OP的平均幅值與OP2子波的潛時、幅值；Cone-ERG的a、b波潛時、幅值；Flick-ERG的峰值幅值。

圖1 F-ERG典型波形

1.5 閃光視覺誘發(fā)電位測量

分別對正常眼壓和造模后2周、4周各6只大鼠用RETI-port/scan 21羅蘭視覺電生理儀(Roland Consult，德國)進行閃光視覺誘發(fā)電位的測量。

實驗前打開實驗臺的水浴加熱裝置，在實驗過程中保持實驗臺溫?zé)?。實驗時，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行全身麻醉，雙眼滴入散瞳液并進行20 min的散瞳，兩耳連線中點處備皮，放置電極。記錄電極置于兩耳連線中點皮下，平行于身體長軸；參考電極插于耳郭，接地電極置于尾部。開始測試前應(yīng)保證各電極阻抗小于5 kΩ。將大鼠置于刺激器內(nèi)，測量眼向內(nèi)，非測量眼用自制不透光眼罩蓋住。測量順序為先測量實驗眼，再測量對照眼。在測量過程中保證周圍環(huán)境其余電源全部關(guān)閉，避免產(chǎn)生干擾。

根據(jù)國際臨床視覺電生理學(xué)會標準化方案對大鼠進行F-VEP測試。采用全視野刺激器，參數(shù)設(shè)置為：閃光顏色白色；刺激頻率1.6 Hz；疊加次數(shù)100次。每只眼連續(xù)測試3次，取其平均值作為最終結(jié)果記錄。閃光視覺誘發(fā)電位的典型波形如圖2所示，負相波用N表示，正相波用P表示，相鄰兩波間的幅值差大小反應(yīng)視神經(jīng)軸索功能狀態(tài)，波形出現(xiàn)的時間點為潛時，其反應(yīng)視神經(jīng)髓鞘功能狀態(tài)。本實驗主要觀察指標包括N1、P1、N2、P2潛時，N1-P1、N2-P2幅值。

圖2 F-VEP典型波形

1.6 孔隙率計算

選取正常和造模后2周、4周各6只大鼠進行篩板形態(tài)學(xué)的觀察。以10 μm厚度對篩板組織進行連續(xù)冷凍切片，一個樣本約保留160 μm，即16張切片，然后通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)對組成其主要結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細胞進行熒光標記。通過LeicaTCS SP8正置激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)的油鏡(物鏡放大倍數(shù)為60倍)對篩板部位組織切片進行圖像采集，將得到的圖像導(dǎo)入ImageJ(NIH，美國)進行篩孔面積和篩板面積的獲取，并計算孔隙率：孔隙率=孔隙面積/總面積。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 眼壓測量結(jié)果

通過對18只正常大鼠清醒狀態(tài)下的眼壓測量(15∶00-16∶30)，得到大鼠正常眼壓左眼為(12.58±1.47)mmHg，右眼為(13.17±2.21)mmHg。

開展教研活動的主要目的是提高教師的專業(yè)素質(zhì)、教學(xué)能力以及課程實踐能力。而若想有效開展好教研活動，以真正發(fā)揮出其作用、實現(xiàn)其目的，首先必須要確保教研活動的科學(xué)規(guī)劃，即明確教研主題，找準問題所在，將教研活動當(dāng)作一項科研活動來開展，并保證其有序進展。

隨機抽取12只大鼠，對這12只大鼠行烙閉鞏膜上靜脈結(jié)合氟尿嘧啶球結(jié)膜下注射方法，以獲得慢性高眼壓模型，分別于烙閉前及烙閉后2 d、1周及每周進行眼壓測量。烙閉前，實驗眼、對照眼眼壓分別為(14.25±2.09)mmHg、(12.70±1.89)mmHg。術(shù)后2 d，實驗眼眼壓顯著上升(P<0.01)，烙閉后1～ 4周，實驗眼眼壓維持較高狀態(tài)(P<0.01)。大鼠雙眼眼壓變化如圖3所示。

圖3 大鼠雙眼眼壓

2.2 閃光視網(wǎng)膜電圖測量結(jié)果

由Diagnosis Espion E3測量得到正常、造模后2周、4周大鼠雙眼的F-ERG各參數(shù)值，每個時間段各6只，所有被測大鼠均能得到典型的ERG波形，記錄的各反應(yīng)參數(shù)值如表1所示。

表1 F-ERG結(jié)果(n=6)

F-ERG各波形參數(shù)分析如下：

(1) 暗適應(yīng)視桿反應(yīng)Rod-ERG：造模后2周、4周大鼠與正常大鼠相比，b波潛時無顯著變化(P>0.05)。高眼壓作用2周后大鼠的b波幅值與正常大鼠、高眼壓作用4周相比均無顯著變化，高眼壓作用4周時b波幅值與正常大鼠相比顯著下降(P<0.01)，說明視桿細胞功能下降。

(2) 暗適應(yīng)最大混合反應(yīng)Max-ERG：高眼壓作用前后a、b波潛時均無明顯改變。高眼壓作用4周時，與正常大鼠相比，a、b波幅值均顯著下降(P<0.01)，但與高眼壓作用2周相比無明顯差別。反映了在慢性高眼壓的作用下，視網(wǎng)膜光感受器層功能受損。

(3) 振蕩電位OP：高眼壓作用前后OP平均幅值與OP2潛時均無顯著變化。高眼壓作用4周時，OP2幅值與高眼壓作用2周時對比，顯著下降(P<0.05)，但與正常組相比無明顯變化(P>0.05)。

(4) 明適應(yīng)視錐反應(yīng)Cone-ERG：高眼壓作用前后a、b波潛時和a波幅值無明顯變化。高眼壓作用4周后，b波幅值與正常大鼠相比顯著下降(P<0.05)，這表明視錐細胞功能在慢性高眼壓作用下降低。

2.3 閃光視覺誘發(fā)電位測量結(jié)果

由羅蘭視覺電生理儀測量得到F-VEP各參數(shù)值，白光刺激頻率為1.6 Hz。每只眼測量3次，取其平均值作為最終結(jié)果。記錄的各參數(shù)值如表2所示。

表2 F-VEP結(jié)果(n=6)

造模2周時，P1潛時與正常大鼠相比顯著降低(P<0.01)，N2潛時顯著升高(P<0.01)，且顯著差異持續(xù)到建模后4周，但高眼壓作用2周、4周間P1潛時與N2潛時無顯著差別；高眼壓作用4周時，N1-P1幅值與造模后2周相比顯著性降低(P<0.01)，但與正常大鼠相比無顯著差異；造模前后P2潛時、N2-P2幅值無顯著變化。

2.4 孔隙率結(jié)果

經(jīng)過GFAP熒光染色后的篩板部位組織切片圖像如圖4所示，綠色熒光處為篩板組織，其中孔隙處為視神經(jīng)軸突穿過區(qū)域；局部放大圖像如圖5所示，可以看到在持續(xù)高眼壓作用下，篩板膠原組織的放射狀形態(tài)被破壞，出現(xiàn)雜亂的膠原纖維和異常的組織間隙。

圖4 GFAP染色后篩板組織圖像

圖5 GFAP染色后篩板組織局部圖像

將圖像導(dǎo)入ImageJ后，將其改為灰度圖像，選取篩板組織邊緣(圖6A)，獲取整體篩板組織面積；分割出篩板從而計算篩孔面積(圖6B)，由孔隙率公式計算獲得篩板孔隙率。

圖6 篩板組織圖像分割

造模前后篩板組織部位孔隙率情況如圖7所示，高眼壓作用2周，篩板組織的孔隙率顯著下降(P<0.01)。高眼壓持續(xù)作用4周后，鼠眼篩板孔隙率較正常大鼠相比無顯著性差異。

圖7 篩板孔隙率變化情況(n=6)

3 討論與結(jié)論

本研究中通過建立動物模型研究慢性高眼壓作用下鼠眼篩板部位的損傷情況，造模方法采取課題組中已成熟使用的烙閉上鞏膜靜脈結(jié)合球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶法[17]，為維持實驗大鼠高眼壓狀態(tài)，定期對其進行眼壓測量，并對眼壓低于25 mmHg的大鼠再次烙閉，實驗結(jié)果顯示，大鼠實驗眼眼壓在烙閉后2 d顯著上升且能維持高眼壓狀態(tài)到4周。

通過F-ERG和F-VEP的測量，本研究得到慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能的損傷情況。結(jié)果顯示，在慢性高眼壓作用2周后，F(xiàn)-VEP的潛時顯著增長，這與ElGohary等[7]觀察到的F-VEP變化結(jié)果一致。Yu等[18]、Chen等[19]同樣發(fā)現(xiàn)慢性高眼壓2周后，VEP的N1、P1潛時增長，平均幅值下降。慢性高眼壓作用4周后，F(xiàn)-ERG的各反應(yīng)幅值顯著下降，這與同一課題組的郭學(xué)謙等[20]所得到的幅值下降結(jié)果相似，且與Wu等[6]、Hannon等[21]得到的慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜損傷結(jié)果相似。本實驗中僅通過測量F-ERG和F-VEP來評估視網(wǎng)膜的功能性改變情況，目前有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-ERG的b波后會產(chǎn)生一負相波，即明視負波反應(yīng)(photopic negative response，PhNR)，反映外層視網(wǎng)膜功能，該指標在早期青光眼患者中就可發(fā)生顯著變化，對于早期青光眼的發(fā)現(xiàn)有重要意義[22]。在下一步工作中，可以增設(shè)對PhNR指標參數(shù)的觀察，獲得其在慢性高眼壓作用下的變化規(guī)律。

研究結(jié)果顯示，造模2周后，篩板組織孔隙率顯著降低；造模4周后，篩板組織孔隙率與對照組相比無明顯變化。視覺電生理結(jié)果顯示,在造模2周后，視網(wǎng)膜功能已產(chǎn)生改變。此前其他研究者[23-24]發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓模型的視覺功能學(xué)結(jié)果發(fā)生改變時，并未觀察到明顯的視網(wǎng)膜形態(tài)的變化，這可能是形態(tài)學(xué)測量的精度不夠所導(dǎo)致的。此外，Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，眼壓升高2周后，ERG的a、b波幅值下降，而視網(wǎng)膜形態(tài)在高眼壓作用4周后才出現(xiàn)顯著變化。但Eastlake等[3]通過ERG測試與掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在高眼壓作用2周后視網(wǎng)膜功能受損，同時觀察到視神經(jīng)的形態(tài)發(fā)生改變，與本文所觀察到的結(jié)果相似。同樣，Tan 等[26-27]通過ERG結(jié)合光學(xué)相干斷層掃描的在體實驗方法發(fā)現(xiàn)，大鼠眼壓升高后ERG的a、b波幅值顯著下降，同時視神經(jīng)乳頭的形態(tài)發(fā)生變化，但由于目前在體測試的圖像精度較低，難以獲得篩板微觀結(jié)構(gòu)的變化情況。

本文研究存在一定的局限性。由于本實驗中慢性高眼壓最長僅維持到4周，并未觀察到完整的視網(wǎng)膜功能損傷、恢復(fù)情況。且在視覺電生理得到的結(jié)果中，實驗眼與對照眼無法體現(xiàn)出顯著性差異，這可能與視覺誘發(fā)電位幅度較低、極易受腦電波干擾等原因有關(guān)，在測量F-VEP的過程中，僅通過遮蓋非測量眼來排除對側(cè)眼的干擾，可能會由于大鼠的麻醉深度淺或自身呼吸起伏而在測量過程中發(fā)生活動，導(dǎo)致遮蓋效果下降。另外，本研究所使用的顯微鏡精度較低，并且圖像處理分割方法較為粗糙，得到的形態(tài)學(xué)參數(shù)較少，難以得到準確的早期篩板微結(jié)構(gòu)改變情況。在下一步工作中，擬采用分辨率更高的圖像采集設(shè)備，如電鏡或具有高分辨率模塊的激光共聚焦顯微鏡，優(yōu)化圖像處理方法，增加慢性高眼壓觀察的時間點，進一步研究慢性高眼壓作用下，視網(wǎng)膜功能學(xué)的改變與篩板微觀結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系，為青光眼致病機制的研究及早期診斷提供依據(jù)。