外源保幼激素對異色瓢蟲卵巢發(fā)育及生殖相關基因轉錄水平的影響

韓 慧, 馮朝陽, 張 碩, 何運轉

(河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 河北保定 071000)

異色瓢蟲Harmoniaaxyridis屬鞘翅目(Coleoptera)瓢蟲科(Coccinellidae)，是重要的捕食性天敵昆蟲之一，對多種害蟲具有良好的生物防治效果(王東昌等, 2001; Koch, 2003; 王媛等, 2015; 巫鵬翔等, 2017)。天敵昆蟲規(guī)模化繁育是生物防治的關鍵環(huán)節(jié)之一，而利用自然獵物進行飼養(yǎng)擴繁受高成本限制，因此人工飼料的研究及應用尤為重要(Coudronetal., 2002; 徐學農(nóng)和王恩東, 2007)。研究發(fā)現(xiàn)以豬肝為原料的人工飼料可以使異色瓢蟲完成世代發(fā)育，但存在產(chǎn)卵前期延長和產(chǎn)卵量低等生殖障礙(郭建英和萬方浩, 2001; 李辰新等, 2017)。路玉婷(2016)研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲取食添加保幼激素(juvenile hormone, JH)類似物的飼料后，可提升成蟲生殖能力，如卵巢發(fā)育加快、交配次數(shù)多和產(chǎn)卵量增多等現(xiàn)象。

研究表明JH受體methoprene-tolerant (Met)和下游轉錄因子krüppel homolog 1 (Kr-h1)在JH調控昆蟲生殖和卵黃發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用(Royetal., 2018; Wuetal., 2021)。通過RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)在蝗蟲類(Songetal., 2014; Gijbelsetal., 2019, 2020)、飛虱類(Linetal., 2016; Huetal., 2019)、蠅類(Yueetal., 2018)、蛾類(Miaoetal., 2020)和瓢蟲類(Huangfuetal., 2021)等昆蟲中Met或Kr-h1基因的缺失抑制了卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)和卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor, VgR)基因轉錄水平，延緩卵巢發(fā)育，并顯著降低了產(chǎn)卵量。這些發(fā)現(xiàn)表明JH信號通路上關鍵基因(Met和Kr-h1)在昆蟲繁殖中的關鍵作用。Liu等(2019)將15 μg的JH類似物注射到新羽化的滯育性大猿葉蟲Colaphellusbowringi雌成蟲體內，結果表明JH通過Met-Kr-h1通路誘導VgR的轉錄，VgR是卵黃原蛋白(Vg)攝取和生殖發(fā)育所必需的。由此可見，Met,Kr-h1,Vg和VgR在JH調控雌性昆蟲生殖過程中占據(jù)重要地位。

本課題組前期未發(fā)表數(shù)據(jù)表明異色瓢蟲卵黃發(fā)生主要由體內JH進行調控，但從分子層面研究其對異色瓢蟲雌成蟲Met,Kr-h1,Vg和VgR基因轉錄水平的影響未見報道。鑒于此，本研究通過對取食人工飼料的異色瓢蟲雌成蟲點滴不同劑量的JHⅢ之后，采用解剖學和qPCR的方法分別進行卵巢發(fā)育和生殖相關基因轉錄水平的研究，以期了解靶標基因是否參與JH調控通路，為探究JH在異色瓢蟲生殖調控分子機制以及規(guī)?；斯わ暳蠑U繁異色瓢蟲提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

異色瓢蟲為室內飼養(yǎng)的種群，在人工氣候箱內以溫度25±1℃，相對濕度65%±5%，光周期16L∶8D的條件下，使用蘿卜蚜Lipaphiserysimi進行飼養(yǎng)，待其成蟲產(chǎn)卵后，選擇發(fā)育整齊的初孵幼蟲備用。按照本課題組室內以豬肝為原料的人工飼料配方進行飼養(yǎng)初孵幼蟲(陳潔, 2011)，每日更換飼料直至成蟲羽化。隨后將同日齡的成蟲按照雌雄1∶1比例進行配對。分別置于一次性塑料圓盒里(半徑5 cm，高6 cm)飼養(yǎng)，并每天更換新飼料。飼養(yǎng)溫度為25±1℃，相對濕度為65%±5%，光周期為16L∶8D。選取羽化后第2天的雌成蟲作為供試昆蟲。

1.2 主要試劑

JHⅢ(65%)購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司；Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix試劑購自蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.3 JHⅢ處理后異色瓢蟲雌成蟲卵巢發(fā)育觀察

用丙酮將JHⅢ溶解成2 mg/mL的母液，以本課題組前期篩選的JHⅢ濃度為參考(未發(fā)表數(shù)據(jù))，再用丙酮稀釋母液至濃度為160, 240和320 ng/μL的稀釋液備用。當異色瓢蟲雌成蟲羽化后第2天在其腹部第1-2節(jié)節(jié)間點滴0.5 μL的不同濃度JHⅢ，相當于每頭雌成蟲點滴JHⅢ為80, 120和160 ng/頭。點滴后1, 3, 5, 7和9 d的雌成蟲于Ringer’s生理鹽水里進行解剖，并將卵巢置于載玻片上，利用SteRE0 Discovery.V20體視顯微鏡(ZEISS，德國)拍照并測量卵巢長度，并進一步測量處理后5, 7和9 d的卵巢第一卵室的長度和寬度，每個處理下每個時間點解剖10～15頭?？瞻讓φ战M為蘿卜蚜飼喂的雌成蟲，溶劑對照組為點滴同體積丙酮溶液的雌成蟲。溶劑對照組和不同濃度JHⅢ處理組點滴處理后均按1.1節(jié)方法用人工飼料繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4 最適劑量JHⅢ處理后雌成蟲生殖信號通路中關鍵基因表達水平檢測

根據(jù)異色瓢蟲轉錄組數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)，已成功鑒定得到了HaMet(GenBank登錄號: MH619532)，HaKr-h1(GenBank登錄號: MK629763)，HaVg(HaVg1和HaVg2 GenBank登錄號分別為KY933792和KY794939)和HaVgR(GenBank登錄號: MG787232)?；诓煌瑒┝縅HⅢ處理后卵巢發(fā)育情況，選取1.3節(jié)120 ng/頭處理后1, 5和9 d的雌成蟲整蟲進行靶標基因表達水平分析，對照組為點滴同體積丙酮溶液的雌成蟲整蟲。每個處理3次重復，每個重復1頭試蟲。按照總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit說明書分別提取每個樣品總RNA，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性和濃度。按照cDNA反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser的要求，以上述總RNA為模板合成cDNA第1鏈。

根據(jù)qPCR引物設計要求，利用DNAMAN軟件設計靶標基因的定量引物(表1)，并用已報道的異色瓢蟲HaEF1為內參基因(Liangetal., 2019)。每個處理3次重復，每個重復1頭試蟲。每樣品技術重復3次。qPCR反應體系: Fast Super-EvaGreen?qPCR 10 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O水補足至20 μL。利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行程序擴增，反應程序: 95℃預變性2 min; 95℃變性5 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，最后以每5 s上升0.5℃的速度從65℃到95℃記錄熔解曲線，通過2-ΔΔCt方法進行相對定量數(shù)據(jù)分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件(IBM, Armonk, NY, 美國)對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，卵巢長度以及第一卵室長度和寬度使用單因素方差(oneway ANOVA)分析中的Tukey氏多重檢驗進行各組之間的顯著性分析，靶標基因表達量采用Student氏t檢驗分析差異顯著性；利用GraphPad Prism 8.0(GraphPad, San Diego, California, 美國)軟件制圖。

2 結果

2.1 不同劑量JHⅢ對異色瓢蟲卵巢發(fā)育的影響

由圖1可知，在不同劑量JHⅢ處理異色瓢蟲羽化后第2天雌成蟲后1 d時卵巢中卵室出現(xiàn)，尚無卵黃沉積，與點滴丙酮的溶劑對照組相比，80和120 ng/頭JHⅢ處理后卵巢發(fā)育加快，處理后5 d卵巢管基部渾濁，開始有少量卵黃沉積，處理后7 d卵巢中出現(xiàn)大量卵黃沉積，處理后9 d卵巢整體亮黃色，大量成熟卵出現(xiàn)，而160 ng/頭JHⅢ處理下，卵巢中只出現(xiàn)卵泡，并無明顯的卵黃沉積現(xiàn)象。120 ng/頭JHⅢ處理7和9 d時卵巢發(fā)育狀態(tài)與蘿卜蚜飼喂的空白對照組的相似。

對不同劑量JHⅢ處理后1, 3, 5, 7和9 d的異色瓢蟲雌成蟲的卵巢長度進行測量分析，發(fā)現(xiàn)卵巢長度均隨著處理時間的增加而持續(xù)變長，溶劑對照組、80和160 ng/頭JHⅢ處理9 d雌成蟲卵巢長度最長，分別為2.08, 2.00和2.01 mm；而蘿卜蚜飼喂組和120 ng/頭JHⅢ處理7 d卵巢長度出現(xiàn)值峰，分別為2.39和2.57 mm，均高于溶劑對照組，其中120 ng/頭JHⅢ處理下卵巢長度顯著高于溶劑對照組(P<0.05)(表2)。

表2 不同劑量JHⅢ處理后不同天數(shù)對異色瓢蟲雌成蟲卵巢長度(mm)的影響Table 2 Effects of different doses of JHⅢ on the ovarian length (mm) of female adultsof Harmonia axyridis at different days after treatment

對不同劑量JHⅢ處理后不同天數(shù)的異色瓢蟲雌成蟲卵巢第一卵室的長度和寬度分別進行了測量，結果表明，120 ng/頭JHⅢ處理下第一卵室長度和寬度均高于蘿卜蚜飼喂的空白對照組和溶劑對照組，其中處理后5和7 d時有顯著差異(P<0.05)；160 ng/頭JHⅢ處理9 d時雌成蟲第一卵室長度和寬度均顯著低于其他處理組的(P<0.05)(表3和4)。

表3 不同劑量JHⅢ處理后不同天數(shù)對異色瓢蟲雌成蟲第一卵室長度(mm)的影響Table 3 Effects of different doses of JHⅢ on the first egg chamber length (mm) of female adultsof Harmonia axyridis at different days after treatment

表4 不同劑量JHⅢ處理后不同天數(shù)對異色瓢蟲雌成蟲第一卵室寬度(mm)的影響Table 4 Effects of different doses of JHⅢ on the first egg chamber width (mm) of female adultsof Harmonia axyridis at different days after treatment

2.2 JHⅢ對異色瓢蟲生殖相關基因表達水平的影響

與對照組(丙酮處理組)比較，120 ng/頭JHⅢ處理后1 d異色瓢蟲雌成蟲中HaMet基因表達量無顯著差異(P>0.05)，處理后5和9 d雌成蟲中HaMet的表達量極顯著上調，分別為對照組的2.78和2.36倍(P<0.01)(圖2: A)；120 ng/頭JHⅢ處理1, 5和9 d的異色瓢蟲雌成蟲HaKr-h1的表達量高于對照組，但無顯著差異(P>0.05)，分別為對照組的1.66, 1.02和1.70倍(圖2: B)。

120 ng/頭JHⅢ處理下異色瓢蟲生殖基因HaVg1,HaVg2和HaVgR表達水平趨勢整體相似，處理后1 d異色瓢蟲雌成蟲HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量分別下調91.47%, 64.24%和62.41%，與對照組有極顯著差異(P<0.01)；處理后5 d雌成蟲HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量極顯著增加(P<0.01)，分別是對照組的13.14, 21.48和8.28倍；處理后9 d雌成蟲HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量高于對照組，其中HaVg1和HaVgR的表達量極顯著上調(P<0.01)，分別約為對照組的1.85和2.01倍(圖3: A, B, C)。

3 討論

目前，飼喂人工飼料是異色瓢蟲大量擴繁的主要飼養(yǎng)方法之一，但取食該飼料后無法滿足異色瓢蟲產(chǎn)卵需求，導致其生殖力下降(陳潔, 2011; 李辰新等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，在人工飼料飼喂異色瓢蟲雌成蟲基礎上點滴80和120 ng/頭JHⅢ后卵巢發(fā)育明顯加快，其中120 ng/頭JHⅢ處理后7 d雌成蟲卵巢長度和第一卵室長寬度均顯著高于點滴丙酮的對照組(P<0.05)(表2～4)，達到蘿卜蚜飼養(yǎng)條件下卵巢發(fā)育狀態(tài)，而高劑量(160 ng/頭)則抑制卵巢發(fā)育，結果表明JHⅢ劑量為120 ng/頭對卵巢發(fā)育表現(xiàn)為正效應，而160 ng/頭可能超出異色瓢蟲接受閾值表現(xiàn)為負效應。Gao等(2022)通過點滴2 μL保幼激素類似物甲氧普烯(15 μg/μL)于生殖滯育的異色瓢蟲雌蟲體表之后，發(fā)現(xiàn)卵巢發(fā)育加快以及卵泡長度顯著增加，使其達到正常生殖狀態(tài)，驗證了外源保幼激素類似物可在一定程度上影響卵巢發(fā)育。

為進一步了解JH對異色瓢蟲生殖的調控機制，本實驗利用qPCR技術從分子水平檢測了JH信號調控通路上的關鍵基因表達水平，結果發(fā)現(xiàn)120 ng/頭JHⅢ處理后異色瓢蟲雌成蟲體內HaMet,HaKr-h1,HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量與對照組有所差異(圖2和3)。這些差異表現(xiàn)在JHⅢ處理后1 d的異色瓢蟲雌成蟲HaMet,HaVg1,HaVg2和VgR的表達量低于對照組，其中HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，卵巢處于卵黃未沉積狀態(tài)(圖1)；處理后5和9 d的雌成蟲HaMet,HaKr-h1,HaVg1,HaVg2和HaVgR的表達量上調，卵巢分別處于卵黃開始沉積和卵黃大量沉積狀態(tài)(圖1～3)，推測上述靶標基因在JH調控卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且這些基因表達量均呈上調趨勢方可促進卵巢卵黃生成。在沙蔥螢葉甲Galerucadaurica成蟲3或5日齡注射濃度為2.5 μg/μL劑量的JH類似物后前4或6 d，GdMet,GdKr-h1和GdVg的表達量均呈顯著上調趨勢，表明JH對其信號通路上相關基因和生殖基因的表達有正向調節(jié)作用(Maetal., 2021a, 2021b)。Yue等(2018)研究發(fā)現(xiàn)JH類似物處理后顯著誘導桔小實蠅Bactroceradorsalis的JH信號通路中Met和Kr-h1基因的上調表達和Vg基因的轉錄，進而促進卵巢發(fā)育。這些結果表明，外源性JH及其類似物(JH analogues, JHAs)可以發(fā)揮內源性JH的作用，并可能直接作用于JH受體進而調控昆蟲生殖行為(Huangetal., 2018)。在雄性昆蟲中也發(fā)現(xiàn)JH可調控相關基因表達量，如將JHII注射到小地老虎Agrotisipsilon初羽化的雄成蟲體內，可誘導Met1,Met2和Kr-h1等基因的轉錄，使雄性附腺的長度增加(Gassiasetal., 2021)。這些結果表明，JH對其信號通路上相關基因和生殖基因的表達在昆蟲中相對保守。

本研究同時也發(fā)現(xiàn)外源JHⅢ處理異色瓢蟲雌蟲后第5天，HaVg1和HaVg2的表達量極顯著增加(P<0.01)(圖3: A, B)。Parthasarathy等(2010)發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜Triboliumcastaneum雌性卵黃發(fā)生前期用10 μg/μL JHⅢ處理后Vg2 mRNA表達量是對照組(丙酮處理組)的9倍。七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata在取食基礎人工飼料的雌成蟲點滴和喂食ZR-512保幼激素類似物，Vg的合成在高峰期比取食人工飼料對照組分別增加44倍和67倍，JH對Vg合成有明顯的促進作用，并作用于轉錄水平(張建中和翟啟慧, 1985)。15 μg的JHA對處于生殖滯育中的大猿葉蟲C.bowringi卵巢發(fā)育具有促進作用，同時在JHA誘導24 h后，Vg1和Vg2的mRNA水平都增加了10倍以上(Liuetal., 2016)。這些結果表明，在雌性生殖過程中，Vg基因表達上調是對JH信號的響應。在大多數(shù)昆蟲物種中JH對其生殖是正相關的，但在社會性昆蟲歐洲熊蜂Bombusterrestris中，JH和Vg水平呈負相關，這是因為JH已從促性腺激素轉變?yōu)椴挥は伒某墒旌头止ふ{節(jié)器，Vg的功能似乎也擴大到類似的角色(Amsalemetal., 2014)。Vargo和Laurel(1994)研究還發(fā)現(xiàn)JH還可以通過刺激Vg的攝取進而影響卵子形成，本研究也發(fā)現(xiàn)120 ng/頭JHⅢ處理下HaVgR表達量在處理后5和9 d異色瓢蟲雌成蟲中極顯著上升(P<0.01)(圖3: C)，分別為溶劑對照組的8.28和2.01倍。有研究也表明外源JH處理后也可以誘導褐飛虱Nilaparvatalugens和紅火蟻SolenopsisinvictaVgR的表達(Chenetal., 2004; Luetal., 2015)。

綜上所述，外源保幼激素可調控取食人工飼料的異色瓢蟲成蟲卵巢發(fā)育，120 ng/頭劑量JHⅢ處理后5和9 d時雌成蟲HaMet,HaKr-h1,HaVg和HaVgR的表達量上調，表明上述基因參與了外源JH調控異色瓢蟲雌成蟲卵巢發(fā)育及卵黃形成的過程，但與內源JH本身對該過程的影響之間是否存在某種聯(lián)系及其具體的調控機制，有待進一步研究。