西伯利亞蝗卵發(fā)育過程的比較轉(zhuǎn)錄組分析及滯育關聯(lián)基因篩選

趙 娜, 呂雪峰, 扈鴻霞, 宋 余, 蔣思涵, 季 榮, 葉小芳,*

(1. 新疆師范大學生命科學學院, 中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心,新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室, 烏魯木齊 830054;2. 新疆畜牧科學院畜牧業(yè)質(zhì)量標準研究所, 烏魯木齊830000)

滯育是動物受到環(huán)境條件誘導所產(chǎn)生的一種靜止狀態(tài)，可發(fā)生在昆蟲的卵、幼蟲、蛹和成蟲任意發(fā)育階段。且滯育可提高昆蟲的越冬存活率，幫助度過不良環(huán)境以維持種群發(fā)育一致(黃少虹, 2009)。目前有關昆蟲滯育的研究主要集中在晝夜節(jié)律、光周期、激素調(diào)節(jié)以及分子調(diào)控等方面，但由于滯育的生理過程非常復雜，且物種和滯育蟲態(tài)不同，滯育機制差別很大，涉及多個通路和基因的表達調(diào)控，因此現(xiàn)有研究對于闡明昆蟲滯育機制遠遠不夠(Wuetal., 2021)。

近年來，昆蟲滯育狀態(tài)下相關差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)和蛋白以及比較分析滯育相關基因在滯育與非滯育個體中的表達動態(tài)的研究報道較多(Zhangetal., 2011; Colinetetal., 2012; Haoetal., 2012; 齊曉陽等, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)，滯育期間昆蟲發(fā)育受阻，代謝通路受到抑制，會引發(fā)一種獨特的基因表達模式(Gongetal., 2013)。通過比較飛蝗Locustamigratoria滯育卵與非滯育卵在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的差異，發(fā)現(xiàn)212個差異表達蛋白，卵滯育相關基因有Gst和JHE等(Tuetal., 2015)。飛蝗成蟲卵巢和脂肪體轉(zhuǎn)錄組共富集到137個DEGs，其中調(diào)控滯育的71個DEGs參與Foxo信號通路(Haoetal., 2019)。傘裙追寄蠅Exoristacivilis的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明滯育相關基因與抗寒、氨基酸代謝和能量代謝通路有關(張博等, 2020)。

西伯利亞蝗Gomphocerussibiricus屬直翅目(Orthoptera)蝗科(Acrididae)，是新疆草原的一種主要優(yōu)勢害蟲，嚴重破壞當?shù)夭輬錾鷳B(tài)，且對農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟影響較大；其卵期持續(xù)近10個月，面對新疆嚴寒冬季，蝗卵可通過進入滯育來抵御寒冷，且滯育維持時間長達5個多月(閆蒙云等, 2018; 趙娜等, 2021)，因此，滯育作為西伯利亞蝗生活史中的一個重要生理階段，對蝗卵的順利孵化和胚后的個體發(fā)育及種群數(shù)量至關重要。目前，有關西伯利亞蝗的研究主要集中在成蟲的呼吸代謝水平、呼吸蛋白表達、酶活性、抗逆物質(zhì)、色素沉著等方面(李娟等, 2014; 李爽等, 2016; 錢雪等, 2016, 2017; Shahetal., 2019)，而有關該物種的滯育研究較少，僅限于蝗卵的滯育形態(tài)描述、發(fā)育及滯育過程的血藍蛋白表達(何立志等, 2017; 閆蒙云等, 2018; 趙娜等, 2021)。究其原因，主要是因為該物種的基因序列信息缺乏，嚴重阻礙了其滯育機理研究。為弄清西伯利亞蝗卵的滯育分子機理，本研究采用高通量測序技術對不同發(fā)育階段蝗卵進行轉(zhuǎn)錄組測序，比較分析蝗卵滯育期和非滯育期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選蝗卵在滯育期間特異性表達或差異表達的滯育關聯(lián)基因，可為該物種的基因組研究提供有用信息資源，且有助于闡明蝗卵滯育的分子調(diào)控機理，為進一步揭示其發(fā)生機制以及實現(xiàn)人工滯育調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蝗蟲

西伯利亞蝗卵于2018年6-8月采于新疆哈密巴里坤縣白石頭鄉(xiāng)的土壤中5 cm處。將采集的西伯利亞蝗雌雄成蟲放置于采集地室外養(yǎng)蟲籠中，用當?shù)貎?yōu)勢作物天山賴草Leymustianschanicus和針茅Stipacapillata進行飼喂，并放置裝有土壤的花盆以供雌蟲產(chǎn)卵。每日定時收集新鮮蝗卵，并將蝗卵埋于室外5 cm深土壤處讓其自然發(fā)育，以供后續(xù)實驗使用。參照閆蒙云等(2018)和王香香等(2019)的方法，每5～8 d取西伯利亞蝗卵進行解剖，觀察胚胎發(fā)育形態(tài)。收集早期發(fā)育階段(early developmental stage, ES)、滯育階段(diapause stage, DS)和滯育后發(fā)育階段(post-diapause developmental stage, PS)的蝗卵，儲存于-80℃超低溫冰箱(三洋MDF-382E，日本)中，每個階段分為3組，每組100粒。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序、組裝及基因功能注釋和分類

采用Trizol Reagent(Invitrogen，美國)提取1.1節(jié)3個階段西伯利亞蝗卵總RNA，檢測合格后進行文庫構建，cDNA文庫構建與測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。測序后，將得到的原始數(shù)據(jù)進行篩選、組裝。使用BLAST軟件(將Unigenes與KEGG, Nr, Nt, Pfam, KOG, Swiss-Prot以及GO數(shù)據(jù)庫比對，獲得西伯利亞蝗卵基因的序列信息及功能信息。

1.3 DEGs篩選及功能注釋

參考序列為Trinity軟件(v2.4.0)拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列，基因表達水平采用FPKM計算。利用DEGseq2確定滯育與非滯育蝗卵間基因表達水平的差異，篩選DSvsES和PSvsDS兩比較組的DEGs條件為padj<0.05且|log2fold change|>1。

GO注釋使用Blast2GO軟件(version 2.5)(https:∥www.geneontology.org/)進行分析。經(jīng)校正q值<0.05的GO條目被認為在DEGs中顯著富集。參考KEGG數(shù)據(jù)庫(http:∥www.genome.jp/kegg/)，使用KAAS軟件(r140224)進行KEGG通路注釋。經(jīng)校正q值<0.05的KEGG通路被認為在DEGs中顯著富集。

1.4 滯育關聯(lián)基因篩選

根據(jù)DSvsES和PSvsDS兩比較組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果、GO和KEGG富集分析結(jié)果并結(jié)合已報道的滯育相關通路，選取Wnt信號通路、胰島素信號通路、Foxo信號通路、細胞周期以及昆蟲激素生物合成通路進行聚類熱圖分析，預測以上通路富集的DEGs在ES, DS和PS階段的表達模式，從而篩選滯育關聯(lián)基因。

1.5 DEGs定量驗證

從1.4節(jié)篩選出的20個滯育關聯(lián)基因中選取6個重要基因進行 qRT-PCR驗證，包括熱激蛋白70kDa(heat shock 70kDa protein, HSPA1 s)基因、海藻糖酶 (trehalase, TREH)基因、海藻糖轉(zhuǎn)運蛋白 (facilitated trehalose transporter1, TRET1)基因、鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CALM)基因、細胞分裂周期14 (cell division cycle 14, CDC14)基因和WNT6(wingless-type MMTV integration site family, member 6)基因，β-actin為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0設計引物，引物序列見表1，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。采用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara, 日本)進行qRT-PCR實驗。反應體系(20 μL): TB Green Premix Ex Taq GC10 μL, 上下游引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL, ES, DS和PS階段西伯利亞蝗卵cDNA模板2 μL, RNase-free ddH2O 6.4 μL。反應程序(WNT6除外): 95℃ 30 s(4.4℃/s); 95℃ 5 s(4.4℃/s), 60℃ 30 s(2.2℃/s), 72℃ 15 s, 40個循環(huán); 95℃ 5 s (4.4℃/s),60℃ 1 min(2.2℃/s), 95℃ 1 s(0.11℃/s)，Acquisition Mode: Continuous；降溫50℃， 30 s(2.2℃/s)。WNT6反應程序: 95℃ 30 s(4.4℃/s); 95℃ 5 s(4.4℃/s)， 65℃ 30 s(2.2℃/s)， 72℃ 15 s, 40個循環(huán)； 95℃ 5 s(4.4℃/s)，60℃ 1 min(2.2℃/s), 95℃ 1 s(0.11℃/s)，Acquisition Mode: Continuous；降溫50℃ 30 s(2.2℃/s)。每組重復3次，結(jié)果采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段西伯利亞蝗卵的轉(zhuǎn)錄組

3個發(fā)育階段的西伯利亞蝗卵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，平均剩余97.97%的高質(zhì)量clean reads。每個樣本Q20均大于97%，Q30均大于93%，說明測序質(zhì)量可靠。對轉(zhuǎn)錄本進行聚類和組裝分析，得到176 081條unigenes，其拼接長度范圍在301～43 324 bp，平均長909 bp，N50為1 221 bp。unigene數(shù)量隨其組裝長度增加呈平緩的下降趨勢，說明原始數(shù)據(jù)拼接質(zhì)量較高，可用于后續(xù)功能注釋和DEGs分析；轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI(GenBank登錄號: SRP239011)。此外，對ES, DS和PS 3個發(fā)育階段共9個樣本的基因表達水平進行聚類分析(圖1: A)及相關性分析(圖1: B)，結(jié)果證明樣本間相似性較高，重復性好，組間樣本差異性較好。

2.2 轉(zhuǎn)錄組序列注釋

通過對獲得的unigene序列與七大數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)：Nr數(shù)據(jù)庫中注釋最多，占33.25%，其后依次是Pfam(占27.72%), GO(占27.72%)，Swiss-Prot(占18.85%)，Nt(占13.23%)，KOG(占8.24%)和KEGG (占2.46%)。

GO注釋分類發(fā)現(xiàn)，所有unigene被注釋在55個功能類別中(圖2)。在生物學過程分類中，注釋基因最多的功能是細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)和單一生物過程(single-organism process)，三者均參與細胞增殖和組織器官發(fā)育。在細胞分組分類中，注釋基因最多的功能是細胞(cell)、細胞部分(cell part)和膜(membrane)。在分子功能分類中，注釋基因最多的功能是結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)和轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)。

KEGG分析將unigene分為5大類——細胞過程(cellular processes)(A)、環(huán)境信息加工(environmental information processing)(B)、遺傳信息加工(genetic information processing)(C)、新陳代謝(metabolism)(D)和生物體系統(tǒng)(organismal systems)(E)，共注釋到32條通路。通過對32條通路下的unigene進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中翻譯(translation)、信號轉(zhuǎn)導(signal transduction)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)通路中涉及的unigene最多(圖3)。

2.3 DEGs篩選

不同比較組DEGs篩選結(jié)果顯示：DSvsES組和PSvsDS組分別有12 419和4 789個DEGs，且這2比較組間共表達的DEGs有2 206個，在上述相應時期特異性表達的DEGs分別有10 213和2 583個(圖4: A)。DSvsES組DEGs中上調(diào)基因6 923個、下調(diào)基因5 496個；PSvsDS組的DEGs較少，其中上調(diào)基因2 612個、下調(diào)基因2 177個。分析發(fā)現(xiàn)，兩比較組的DEGs均上調(diào)表達居多(圖4: B)。

2.4 DEGs的GO功能注釋

DSvsES組中(圖5: A)， DEGs富集的分子功能占比較大，有14條；細胞組分分類有5條；生物學過程分類中僅有1條，被注釋為細胞骨架組織(cytoskeleton organization)。第2圈中顏色越紅，q值越小，富集越顯著。其中，富集最顯著的GO條目為GO:0005515，被注釋為蛋白結(jié)合(protein binding)；其次為GO:0003779, GO:0008092和GO:0007010，分別被注釋為肌動蛋白結(jié)合(actin binding)、細胞骨架蛋白結(jié)合(cytoskeletal protein binding)、細胞骨架組織，這都對胚胎發(fā)育具有重要作用。第3圈表示該GO條目中上調(diào)、下調(diào)的DEGs數(shù)量，其中，DSvsES組的GO條目中基因上調(diào)表達居多，且GO:0008076, GO:0034705, GO:0005249, GO:0005267和GO:0022836等條目中上調(diào)基因所占比例較大，經(jīng)注釋發(fā)現(xiàn)其均與通道活動和通道復合物相關。

由圖5(B)可知，PSvsDS組中，DEGs富集的前20條GO條目中分子功能所占比例較大，細胞組分次之，生物學過程最少。第2圈富集顯著性表明，PSvsDS組中富集最顯著的功能條目是GO:0042302，被注釋為表皮結(jié)構組成(structural constituent of cuticle)；其次是GO:0015926, GO:0004564和GO:0090599，分別被注釋為葡糖苷酶活性(glucosidase activity)、β-呋喃果糖苷酶活性(beta-fructofuranosidase activity)和α-葡萄糖苷酶活性(alpha-glucosidase activity)。根據(jù)第3圈DEGs上調(diào)、下調(diào)的DEGs數(shù)量可以看出，PSvsDS組中上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)總和基本一致。此外，除富集顯著的前4條GO條目外，還富集到與胚胎發(fā)育有關的GO條目(GO:0007423, GO:0015629和GO:0003779)，分別被注釋為感覺器官發(fā)育(sensory organ development)、肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)和肌動蛋白結(jié)合。PSvsDS組中DEGs富集的GO條目主要包含酶活性、細胞骨架構建及蛋白結(jié)合等過程。

2.5 DEGs的KEGG富集

DSvsES組(圖6: A)，富集最顯著的前20條通路中，前3條通路分別是軸突導向(axon guidance)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)和癌癥通路(pathways in cancer)，此外，還富集到與生長發(fā)育相關的通路，如脂肪細胞脂肪分解調(diào)控(regulation of lipolysis in adipocyte)、細胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAMs)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路(signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)、甘油磷脂新陳代謝(glycerophospholipid metabolism)和血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等。富集到的DEGs主要有GSK3B,PKA,PLCB,WNT7,WNT6,CSNK1E,WIF1,AKT,HSPA1s和NOS1等。

PSvsDS組中(圖6: B)，除與人類疾病相關的麻疹(measles)通路外，DEGs富集最顯著的通路是抗原加工提呈(antigen processing and presentation)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)和吞噬體(phagosome)。此外，還富集到肌動蛋白細胞骨架調(diào)控(regulation of actin cytoskeleton)、調(diào)節(jié)干細胞多能性信號通路(signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)、癌癥通路(pathways in cancer)、趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)、胰島素信號通路(insulin signaling pathway)等，富集到的DEGs主要有IFI30,CTSL,NLK,MKP,TUBB,TUBA,LIMK1,VAV,MYL2,WNT11,JNK,PRKCZ,FBP,AKT和FASN等。

2.6 滯育關聯(lián)基因

結(jié)果顯示，Wnt信號通路中富集的DEGs有20個(圖7: A)，除PRKCA外，其余基因表達量均在DS階段呈上調(diào)表達。WNT6,NLK,RVB1,JNK和GSK3B在ES, DS和PS 3個階段表達量整體呈下降-上升-下降的表達趨勢，WNT11表達量在DS階段也顯著上調(diào)。PRKCA,CNB,WISP1,RHOA,WNT7和SMAD2_3的表達模式整體呈上升趨勢，在PS階段表達量最高。此外，WIF1與SFRP5作為Wnt信號通路的抑制基因，SFRP5表達量逐漸增加；WIF1表達量在DS階段表達量最高，PS階段雖仍呈上調(diào)表達，但表達量較DS階段有所下降。

胰島素信號通路在3個階段中富集到15個DEGs(圖7: B)。在西伯利亞蝗卵整個發(fā)育過程中FASN,AKT,MNK,JNK,GSK3B和FBP這6個基因表達量明顯呈先升后降的趨勢，在DS階段表達量最高。CALM和KRAS在ES至PS階段表達量上調(diào)，在PS階段達到最高。PKLR這一丙酮酸激酶基因在ES階段表達量最高，而在DS階段表達量最低。

Foxo信號通路所富集的DEGs有10個(圖7: C)，其中NLK,AKT和JNK的表達量在整個發(fā)育過程呈上升-下降的表達趨勢，在DS階段最高。僅富集到1個F-box蛋白家族基因為FBXO25_32，其表達量在整個發(fā)育過程逐漸升高，在PS階段達到最大值；與FBXO25_32表達趨勢相同的基因還有PLK2,PIK3R1_2_3和SMAD2_3。SIRT1則在ES階段表達量上調(diào)，隨后逐漸降低。

細胞周期通路中共有7個DEGs(圖7: D)，分別是GSK3B,MPS1,MCM2,CDH1,SMAD2_3,SCC3和CDC14,且較ES階段均上調(diào)表達。GSK3B,MPS1,MCM2和CDC14在DS階段表達量較高，在DS至PS階段表達量下降。

昆蟲激素生物合成通路中僅富集到2個DEGs (SAD和SPO)(圖7: E)。在ES至DS階段，SAD與SPO均呈上調(diào)表達，其中SPO表達量較高；在DS至PS階段，兩者表達量均有所降低。

綜合GO功能、KEGG富集分析以及部分通路的聚類熱圖分析結(jié)果，篩選出20個重要的滯育關聯(lián)基因(表2)。

2.7 qRT-PCR驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準確性，根據(jù)DEGs的GO功能和KEGG富集分析結(jié)果，并結(jié)合相關文獻報道，從20個滯育關聯(lián)基因中選取與糖代謝、環(huán)境脅迫、生長發(fā)育以及細胞周期進程相關的6個基因進行qRT-PCR驗證。結(jié)果顯示，qRT-PCR檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(FPKM)表達趨勢基本一致(圖8)。

3 討論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對西伯利亞蝗卵早期發(fā)育(DS)、滯育(ES)及滯育后發(fā)育階段(PS)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)DSvsES和PSvsDS兩比較組的DEGs均上調(diào)表達居多(圖4)，說明滯育階段生理活動和生長速度雖然較慢，但一些基因仍呈上調(diào)表達。GO條目富集圖分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，DSvsES組富集最顯著的GO條目被注釋為蛋白結(jié)合，其次為肌動蛋白結(jié)合、細胞骨架蛋白結(jié)合等；PSvsDS組中DEGs富集的GO條目主要包含酶活性、細胞骨架構建及蛋白結(jié)合等過程，對胚胎發(fā)育具有重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路與生長發(fā)育息息相關，在胚胎分化、控制胚胎軸向的正常發(fā)育中起關鍵調(diào)控作用(Reya and Clevers, 2005)。Wnt信號失調(diào)將導致骨骼肌發(fā)育產(chǎn)生缺陷或胚胎夭折(Ridgewayetal., 2000; 韓琳和馮新港, 2008; 張宗明等, 2019)。本研究中，Wnt信號通路顯著富集(q<0.05)，富集的Wnt基因為WNT6和WNT7，推測WNT6和WNT7可能對西伯利亞蝗卵胚胎組織及神經(jīng)發(fā)育具有重要作用。此外，蝗卵在ES至DS階段的WNT6和WNT7均呈上調(diào)表達，而DS至PS階段WNT6呈下調(diào)表達，WNT7則持續(xù)上調(diào)(圖7: A)，說明蝗卵的上皮組織可能在滯育階段已經(jīng)發(fā)育完善，而神經(jīng)發(fā)育是一個持續(xù)過程，在滯育后發(fā)育階段WNT7的上調(diào)表達使該發(fā)育過程更加活躍。Gros等(2009)證明由WNT11介導的PCP通路能直接影響早期肌細胞定向生長，本研究中WNT11基因在PSvsDS組的調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路中顯著富集，因此認為WNT11對西伯利亞蝗卵肌細胞的定向生長極為重要，為后續(xù)蝗蟲發(fā)育生物學研究提供了方向。此外，WIF1與SFRP5作為Wnt信號通路的抑制基因，SFRP5表達量逐漸增加，WIF1表達量則在滯育階段最高，說明這些抑制因子可能協(xié)同調(diào)控蝗卵發(fā)育。

已有研究表明，SAD和SPO屬于蛻皮類固醇酶，且均為細胞色素P450酶(Ogiharaetal., 2017)；細胞色素P450在合成蛻皮激素過程中起關鍵作用，而蛻皮激素又在滯育調(diào)節(jié)中具有重要作用(Gilbert and Warren, 2005; Cuietal., 2019)。甘藍夜蛾Mamestrabrassicae中SPO的表達高于其他促蛻皮激素基因，且SAD和SPO在滯育期間表達量均降低(Ogiharaetal., 2017)，而西伯利亞蝗卵的SAD與SPO在DSvsES組均呈上調(diào)表達，且滯育階段SPO表達量更高，推測蝗卵滯育期SPO在蛻皮激素合成過程中起主要作用。此外，本課題組通過檢測西伯利亞蝗卵各階段蛻皮激素含量，發(fā)現(xiàn)滯育階段的蝗卵蛻皮激素含量高于早期發(fā)育階段(未發(fā)表)，這與本研究中蝗卵SAD和SPO的表達趨勢一致(圖7: E)，由此推測在蝗卵整個發(fā)育過程中SAD與SPO協(xié)同調(diào)控蝗卵發(fā)育，但其具體功能還需進一步驗證。

表2 西伯利亞蝗卵潛在的滯育關聯(lián)基因Table 2 Potential diapause-associated genes of Gomphocerus sibiricus eggs

本研究中，DSvsES組有4個基因(Cluster-37469.111066, Cluster-37469.103701, Cluster-37469.68378和Cluster-37469.32248)共同編碼熱激蛋白；其中，Cluster-37469.111066被注釋為差異基因HSPA1s，且呈上調(diào)表達。定量研究發(fā)現(xiàn)，HSPA1s在PS階段仍呈上調(diào)表達。蝗卵在滯育期間，為應對外界低溫，通過升高HSPA1s的表達從而順利度過滯育期；隨著外界環(huán)境溫度升高，蝗卵解除滯育，HSPA1s表達量仍然升高，可能是因為剛解除滯育的蝗卵還不能完全適應外界環(huán)境變化，仍需合成大量熱激蛋白以幫助蝗卵應對外界環(huán)境。皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai幼鮑在經(jīng)過熱激后其HSPA1s的表達水平顯著上調(diào)(高婷婷, 2019)，這與西伯利亞蝗卵滯育后發(fā)育階段HSPA1s的表達趨勢一致；而麥紅吸漿蟲幼蟲破繭恢復發(fā)育后HSP則降至最低水平(趙佳佳等, 2018)，說明熱激蛋白在不同物種體內(nèi)調(diào)控機制不同。HSP90A可與類固醇受體和激酶結(jié)合，PSvsDS組中HSP90A(cluster-37469.5850)呈下調(diào)表達，說明蛻皮類固醇激素水平相應較低，這與蝗卵中蛻皮激素相關基因SPO表達趨勢一致。絲光綠蠅Luciliasericata中HSP90的表達不受滯育影響，但在滯育后發(fā)育過程其表達量迅速上調(diào)(Rinehartetal., 2007)，說明不同熱激蛋白在卵滯育及滯育解除過程中可具有不同功能。

昆蟲滯育的一個重要標志是細胞周期停滯(Kostáletal., 2009)，而胚胎滯育通常發(fā)生在細胞周期的S期之前(Pavlidesetal., 2011)。CDC14為細胞分裂所必需，采用RNAi干擾秀麗隱桿線蟲CaenorhabditiselegansCDC14的表達后出現(xiàn)胚胎死亡(Grunebergetal., 2002)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在細胞周期通路中CDC14,MCM2,MPS1以及GSK3B在DS階段表達量最高(圖7: D)，說明這4個DEGs在蝗卵滯育階段發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。尤其是MPS1和MCM2這2個基因僅在PSvsDS組被注釋為DEGs，說明這2個基因可能對蝗卵滯育解除也具調(diào)控作用。細胞分裂周期蛋白(CDC14)廣泛參與調(diào)控細胞周期中各生理過程。如，CDC14在真核生物DNA合成后期阻滯中發(fā)揮穩(wěn)定的保守性作用(蘇日古嘎和孟峻, 2018; 劉儒等, 2019)。由此推測DS階段MCM2與CDC14可協(xié)同影響西伯利亞蝗卵滯育期的DNA復制與細胞周期進程。

昆蟲胰島素信號通路能夠介導糖原合成酶激酶3基因(GSK3B)調(diào)控體內(nèi)糖原及海藻糖等糖代謝過程，從而控制昆蟲的各項生命活動；GSK3B可使糖原合成酶磷酸化，導致糖原合成酶失活，并阻礙胰島素信號通路的傳導，從而抑制糖原合成(丁艷娟等, 2019)。本研究中，DSvsES組胰島素通路(P<0.05)有13個DEGs，除丙酮酸激酶基因(PKLR)下調(diào)表達外，其余基因均上調(diào)表達。與早期發(fā)育階段相比PKLR在滯育期下調(diào)表達，可有效促進糖酵解的發(fā)生，表明西伯利亞蝗卵在早期發(fā)育階段的糖酵解通路較活躍，在滯育階段其糖代謝活性降低，可為蝗卵的滯育維持以及后期發(fā)育提供能量。GSK3B在蝗卵滯育階段上調(diào)表達，導致蝗卵機體內(nèi)糖原含量減少，滯育后發(fā)育階段則顯著下調(diào)，促進糖原和海藻糖之間轉(zhuǎn)化，在滯育期通過調(diào)控胰島素信號通路及海藻糖代謝通路等相關基因表達來調(diào)控蝗卵的糖原及海藻糖代謝，以維持蝗卵滯育期的正?；钚?；通過對滯育相關通路進行聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)(圖7)，GSK3B在分析的各通路中均有表達，這印證了該基因在西伯利亞蝗卵發(fā)育過程中具有非常重要的作用。TREH在西伯利亞蝗卵滯育期的上調(diào)表達，可導致滯育蝗卵的海藻糖含量降低，這與西伯利亞蝗滯育卵內(nèi)糖原和海藻糖含量較低的結(jié)果(Songetal., 2021)一致。脂質(zhì)是滯育昆蟲的基礎能量來源，也是胚胎發(fā)育的主要能源(夏丹等, 2016)。脂肪酸合成酶是合成脂肪酸的關鍵酶，與滯育昆蟲的脂質(zhì)積累密切相關，HSL作為激素敏感脂肪酶基因，可調(diào)動儲存的脂肪用于氧化供能(閆昭明等, 2021)。本研究中，西伯利亞蝗卵滯育階段FASN和HSL的上調(diào)表達，有利于蝗卵在滯育期積累大量脂肪，且HSL可氧化脂肪，為滯育蝗卵供能，這與美國白蛾Hyphantriacunea的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果(Dengetal., 2018)一致。鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CALM)作為Ca2+信號傳導通路中的主要信號轉(zhuǎn)導分子，可調(diào)節(jié)細胞增殖、激素分泌等重要生理過程(趙嵐等, 2007)。本研究中，在PSvsDS組，胰島素通路中CALM的持續(xù)上調(diào)表達說明該基因?qū)ξ鞑麃喕嚷寻l(fā)育具有重要意義。

除上述滯育相關通路中所富集的DEGs外，還有部分基因在DSvsES組和PSvsDS組中差異顯著。其中，精氨酸琥珀酸合酶(ASS1)是精氨酸生成的限速酶，精氨酸又可以通過一氧化氮合酶(NOS)生成NO，NO則作為一種重要的信息分子參與調(diào)節(jié)昆蟲的嗅覺、視覺和發(fā)育(王曉安和鄭哲民, 2003; 黃祝, 2014)。西伯利亞蝗卵在滯育階段，其ASS1和NOS1都呈上調(diào)表達，推測蝗卵可能通過大量表達ASS1和NOS1使得NO含量增加，從而調(diào)控蝗卵復眼的發(fā)育，滯育蝗卵的復眼已基本發(fā)育完成，且有大量色素堆積；PLK2作為polo樣激酶在細胞周期中具有重要作用(Maetal., 2003)，且PLK2的過表達可促進糖原合成酶激酶GSK3B磷酸化，而PLK2敲除則降低GSK3B磷酸化水平(Fanetal., 2021)，結(jié)合本研究結(jié)果，推測PLK2在蝗卵滯育階段的上調(diào)表達可能參與蝗卵滯育的關鍵調(diào)控。