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    外源誘導(dǎo)物對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K的影響

    2022-10-18 04:52:04溫欽友葉燕芳鄭政淮張亞如陳麗晨黃志偉
    食品研究與開發(fā) 2022年19期
    關(guān)鍵詞:水合谷氨酸固態(tài)

    溫欽友,葉燕芳,鄭政淮,張亞如,陳麗晨,黃志偉*

    (1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點實驗室,福建 福州 350002)

    紅曲米是將紅曲霉(Monascus)接種到大米中發(fā)酵制備而成的,含有多種活性物質(zhì),是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥,也可作為食品的染色劑和防腐劑、治療消化不良等。紅曲米的生理功能主要來源于紅曲霉的活性代謝產(chǎn)物[1],如莫納可林K[2](monacolin K,MK)、γ氨基丁酸和色素等[3]。其中MK具有降低膽固醇、抗癌防癌、神經(jīng)保護、抗炎抑菌等功效[4-6]。MK又稱洛伐他?。╨ovastatin),最早由日本學(xué)者遠藤章于1979年從紅色紅曲霉(M.ruber)的發(fā)酵產(chǎn)物中首次分離獲得[7],MK可通過競爭性抑制膽固醇合成限制酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HMGR)的活性而抑制膽固醇的合成,從而降低人體和動物血液中的膽固醇水平[8]。研究表明,在紅曲米中至少含有14種具有降血脂功能的物質(zhì),包括莫納可林K、莫納可林J、莫納可林L、莫納可林M、莫納可林X及它們的酸式結(jié)構(gòu)、脫氫莫納可林K、二氫莫納可林L、康伐他汀等[9]。除了產(chǎn)生具有降血脂作用的活性物質(zhì),多數(shù)紅曲霉菌株還會產(chǎn)生具有肝腎毒性的桔霉素,這種毒素的存在限制了紅曲霉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。但不同紅曲霉菌株產(chǎn)桔霉素的能力差異很大,Dai等[11]從商業(yè)紅曲產(chǎn)品中分離出4株叢毛紅曲霉菌株 MS-1、YDJ-1、YDJ-2 和 K104061,且發(fā)現(xiàn)這4株叢毛紅曲霉在高產(chǎn)MK的同時不產(chǎn)桔霉素,這對叢毛紅曲霉的進一步開發(fā)利用具有深遠意義。

    他汀類藥物已成為降血脂治療的主流藥物[12-13],因此如何提高發(fā)酵產(chǎn)物中的MK產(chǎn)量是紅曲霉領(lǐng)域近年來的研究熱點。一般紅曲霉產(chǎn)MK的常見發(fā)酵模式有固態(tài)發(fā)酵(solid state fermentation,SSF)和液態(tài)發(fā)酵(submerged fermentation,SmF)[2]。相比 SmF,SSF 法有許多優(yōu)勢,如真菌在SSF中能夠產(chǎn)生更高活性的酶,因而代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也更高,甚至能夠產(chǎn)生SmF下無法生成的酶類[14],還有研究發(fā)現(xiàn),SSF下紅曲霉的MK合成速率、甘油消耗率、生物量的積累速率、細胞膜的流動性與滲透性以及甘油耐受濃度都明顯高于SmF下的紅曲霉[15-16],SSF發(fā)酵的MK產(chǎn)量高出SmF下的數(shù)倍甚至數(shù)十倍[17-18]。

    向紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中添加碳源(甘油、葡萄糖、乳糖等)、氮源(谷氨酸、大豆粉、蛋白胨等)、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì),也是提高其MK產(chǎn)量的有效方法之一。甘油常作為碳源,用于紅曲霉的MK發(fā)酵[15]。Shi等[19]通過生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),在紅曲霉發(fā)酵過程中甘油加速了其糖酵解和碳代謝。也有研究指出甘油不僅被紅曲霉用作碳源,而且直接參與其代謝[20]。這些研究表明,甘油作為碳源在紅曲霉發(fā)酵中起到了很好的促進作用。氮源是真菌菌絲生長必需的營養(yǎng)物質(zhì),也能促進 MK 合成,如 NaNO3[21]、大豆粉[22]等,張占軍等[23]利用響應(yīng)面法研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)接種量為17.50%、裝料量為32.95 g/250 mL、玉米粉添加量為3.80%和蛋白胨添加量為2.37%時,煙色紅曲霉(Monasucs fuliginosus Sato)固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量最高。此外,將一些氨基酸作為氮源或前體物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中,能顯著提高紅曲霉的MK產(chǎn)量[24],如谷氨酸[25]、蛋氨酸[26]。對于紅曲霉等許多絲狀真菌,某些單價和二價陽離子對其細胞的生長和代謝產(chǎn)物的合成都具有重要的促進作用,Panda等[27]研究發(fā)現(xiàn)MgSO4、NH4Cl和NaCl均能大幅度提高紫色紅曲霉菌株MTCC 369的MK產(chǎn)量,MnSO4和CaCl2也有促進效果。Dikshit等[28]對紫色紅曲霉(M.purpureus)與血紅紅曲霉(M.sanguineus)兩種菌株的SSF培養(yǎng)基進行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MgSO4·7H2O和MnSO4·7H2O對兩種菌株的MK產(chǎn)量都有顯著的促進作用。

    目前,紫色紅曲霉、紅色紅曲霉和叢毛紅曲霉為紅曲發(fā)酵生產(chǎn)中3種主要紅曲霉,國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于提高紅曲霉MK產(chǎn)量的研究報道,多以紅色紅曲霉和紫色紅曲霉的研究為主,關(guān)于叢毛紅曲霉的文獻報道較少。因此,根據(jù)前期研究結(jié)果,選擇11種對紅曲霉MK產(chǎn)量具有顯著提高效果的外源誘導(dǎo)物,研究其對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響,從而為叢毛紅曲霉更好地應(yīng)用于高MK紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 菌株與試劑

    叢毛紅曲霉(Monascus pilous)菌株 CICC 5045:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。葡萄糖、瓊脂粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、蛋氨酸、谷氨酸、三水合乙酸鈉、二水合檸檬酸鈉、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、CaCl2、CoCl2·6H2O(均為分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純):格雷斯(中國)有限公司;MK標準品(洛伐他汀≥98%):中國食品藥品檢定研究院。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    中藥粉碎機(50 g,LG-01):瑞安市百信藥機有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋(MJ-54A):施都凱儀器設(shè)備有限公司;超低溫保存箱(MDF-382E):日本三洋電機貿(mào)易會社;電子天平(BSA2202S-CW)、電子天平(BSA-124S-CW):賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;水浴鍋(HH-2):江蘇金壇精達儀器制造廠;潔凈工作臺(VS-1300LU):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫搖床(ZHWY-200D):上海智城分析儀器制造有限公司;霉菌培養(yǎng)箱(MJX-50):寧波江南儀器廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9005):上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高效液相色譜儀(e2695):美國沃特斯公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:200 g新鮮土豆,削皮、切塊,于沸水中煮20 min至煮爛成汁,經(jīng)4層紗布過濾后,加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g,加水溶解后定容至1 000 mL,121℃下高壓滅菌20 min。

    種子液培養(yǎng)基:葡萄糖60g、蛋白胨20g、NaNO32g、KH2PO41 g、MgSO41 g,于250 mL三角瓶中裝入100 mL種子液培養(yǎng)基,121℃下高壓滅菌20 min。

    固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:取30 g大米,加入6 g甘油與20 mL水,封口后于121℃下高壓滅菌20 min。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法

    叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法參照Zhang等[15]與陳慎等[29]的研究方法:用無菌水沖洗PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d~14 d的紅曲霉孢子并輕輕刮下,倒入種子液培養(yǎng)基中。將種子液培養(yǎng)基置于28℃恒溫搖床內(nèi),160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后,取8 mL種子培養(yǎng)液,加入到裝有固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的塑料發(fā)酵瓶內(nèi),并置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d,待米粒長滿菌絲后,加入20 mL無菌水,隨后每日加水5 mL并將米粒搖勻打散,培養(yǎng)至第15天,發(fā)酵完成。

    1.2.2 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的單因素試驗設(shè)計

    在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別加入蛋氨酸(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g)、谷氨酸(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g)、三水合乙酸鈉(0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mg/g)、二水合檸檬酸鈉(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g)、FeSO4·7H2O(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/g)、MgSO4·7H2O(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g)、ZnSO4·7H2O(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g)、MnSO4·H2O(1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mg/g)、Na2MoO4·2H2O(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g)、CaCl2(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g)、CoCl2·6H2O(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g),培養(yǎng)基的其他成分及培養(yǎng)條件均保持一致,同時以不添加外源誘導(dǎo)物的固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照,按照1.2.1中的方法進行叢毛紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后,檢測發(fā)酵產(chǎn)物的MK含量,每個處理設(shè)4個重復(fù)。

    1.2.3 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

    根據(jù)固態(tài)發(fā)酵的單因素試驗結(jié)果,選取MK產(chǎn)量提高效果最顯著的3種外源誘導(dǎo)物,進行外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面試驗設(shè)計,因素水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

    1.2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的高效液相色譜檢測

    待測樣品的前處理:將發(fā)酵培養(yǎng)后的紅曲米樣品置于60℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重,隨后將紅曲米研磨粉碎并過80目篩,取1 g粉末置于10 mL離心管中,加入75%乙醇定容至10 mL,超聲處理30 min,期間搖勻1次,待超聲完成后再搖勻1次,并靜置5 min,隨后取上清液,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)進樣檢測。

    酸型MK標準溶液的配制:稱取1.50 mg MK標準品,置于10 mL棕色容量瓶中,加入2 mL 0.2 moL/L NaOH溶液,用75%乙醇溶解后定容至10 mL,50℃水浴30 min,期間振搖2次,使內(nèi)酯型MK轉(zhuǎn)化為酸型MK,配制成150 μg/mL的標準溶液,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    內(nèi)酯型MK標準溶液的配制:稱取1.50 mg MK標準品,置于10 mL棕色容量瓶中,用75%乙醇溶解后定容至10 mL,配制成150 μg/mL標準溶液,置于4℃下冰箱中存?zhèn)溆谩?/p>

    HPLC檢測的色譜條件:Waters高效液相色譜儀(e2695),色譜柱為 SunfireC18(5μm,250mm×4.6mm);流動相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液=55∶45(體積比);流速為1 mL/min;紫外檢測器的波長為238 nm;柱溫為30℃;進樣量為 20 μL。

    待測樣品中MK含量(mg/kg)的計算公式如下。

    式中:W(MK)為樣品中 MK 含量,mg/kg;C(MK)為MK標準品濃度和待測樣品目標物質(zhì)峰面積(A)的比值,μg/mL;m為待測樣品的質(zhì)量,g。

    1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

    采用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同誘導(dǎo)物對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響

    2.1.1 蛋氨酸對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    蛋氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響見圖1。

    圖1 蛋氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of methionine concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖1可知,不同添加量的蛋氨酸,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對照組沒有顯著差異。氨基酸是一種有機氮源,在叢毛紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵中添加蛋氨酸相當(dāng)于添加有機氮源,其對叢毛紅曲霉的生長發(fā)育具有重要意義[30]。但本研究中不同添加量的蛋氨酸,對叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量沒有顯著促進作用,因此,可

    不添加蛋氨酸。

    2.1.2 谷氨酸對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響谷氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖2。

    圖2 谷氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.2 Effect of glutamic acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖2可知,添加谷氨酸可顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量(P<0.05)。當(dāng)谷氨酸添加量為0.50 mg/g時,MK產(chǎn)量可達227.29 mg/kg,比對照組的MK產(chǎn)量提高了57.9%,因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,谷氨酸的最適添加量為0.50 mg/g。添加谷氨酸能夠顯著提高紅曲霉的MK產(chǎn)量,其原因可能是谷氨酸能夠改變紅曲霉的細胞形態(tài),從而增加MK的分泌[25]。此外,Zhang等[31]的研究結(jié)果表明,谷氨酸能提高紅曲霉MK合成相關(guān)基因的表達,從而促進MK的合成。

    2.1.3 三水合乙酸鈉對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    三水合乙酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖3。

    圖3 三水合乙酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.3 Effect of sodium acetate concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖3可知,不同添加量的三水合乙酸鈉,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對照組沒有顯著差異。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,可不添加三水合乙酸鈉。三水合乙酸鈉對紅曲霉發(fā)酵的MK合成有一定的促進作用,但三水合乙酸鈉添加量過高會使培養(yǎng)基的pH值升高,從而不利于菌體的生長,進而抑制MK的合成[32]。

    2.1.4 二水合檸檬酸鈉對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    二水合檸檬酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖4。

    圖4 二水合檸檬酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖4可知,不同添加量的二水合檸檬酸鈉,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對照組沒有顯著差異。二水合檸檬酸鈉對紅曲霉發(fā)酵的MK合成有一定的促進作用,可能是由于二水合檸檬酸鈉在水解時會釋放堿性離子,使紅曲霉發(fā)酵環(huán)境的pH值穩(wěn)定在一定范圍內(nèi),起到了緩沖作用,從而調(diào)節(jié)菌體細胞的滲透壓[33]。但本研究中不同添加量的二水合檸檬酸鈉,均未顯著提高叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,可不添加二水合檸檬酸鈉。

    2.1.5 FeSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    FeSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖5。

    圖5 FeSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.5 Effect of FeSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖5可知,不同添加量的FeSO4·7H2O,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對照組沒有顯著差異。楊東成等[34]研究了3種金屬離子對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生色素的影響,發(fā)現(xiàn)低濃度Fe2+能提高紅色素的產(chǎn)量。馮光志等[35]的研究表明,F(xiàn)e2+會促進某些真菌的菌絲生長,但其添加量超過279.3 mg/kg時反而抑制菌絲的生長。所以,推測適當(dāng)添加量的Fe2+會促進叢毛紅曲霉的菌絲生長,進而促進MK合成。但本研究中不同添加量的FeSO4·7H2O,均未明顯提高叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,可不添加FeSO4·7H2O。

    2.1.6 MgSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    MgSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖6。

    圖6 MgSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖6可知,不同添加量的MgSO4·7H2O,對提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為1.50 mg/g時,MK產(chǎn)量達到最大(212.03 mg/kg),與對照組的差異達到極顯著水平(P<0.01),比對照組的MK產(chǎn)量提高了46.5%;當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0~1.50 mg/g時,叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量隨MgSO4·7H2O添加量的增加而增加。分析其原因,可能是Mg2+為真菌生長所需的微量元素[36]。Mg2+還能夠促進土曲霉洛伐他汀合成前體物質(zhì)的積累和菌體發(fā)育,從而提高洛伐他汀產(chǎn)量[37]。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量大于1.50 mg/g時,叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的提高效果隨MgSO4·7H2O添加量的增加而下降。分析其原因,可能是叢毛紅曲霉生物量的快速積累,導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,進而造成MK產(chǎn)量的下降[38]。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,MgSO4·7H2O的最適添加量為1.50 mg/g。

    2.1.7 ZnSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    ZnSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖7。

    圖7 ZnSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.7 Effect of ZnSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖7可知,不同添加量的ZnSO4·7H2O,對提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)ZnSO4·7H2O添加量為2.50 mg/g時,MK產(chǎn)量達到最大(237.86 mg/kg),與對照組的差異達到極顯著水平(P<0.01),比對照組的MK產(chǎn)量提高了136.2%;隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加,叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。分析其原因,可能是Zn2+能夠提高叢毛紅曲霉的色素產(chǎn)量[39],而色素與MK同為聚酮化合物,因此添加Zn2+對叢毛紅曲霉的MK合成也有一定的促進作用,從而提高MK產(chǎn)量。當(dāng)ZnSO4·7H2O的添加量大于2.50 mg/g時,叢毛紅曲霉產(chǎn)MK的增長速率隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加而下降,可能是較高添加量的ZnSO4·7H2O促進叢毛紅曲霉生物量的快速積累,導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)過快消耗,從而影響其代謝產(chǎn)物的合成。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,ZnSO4·7H2O的最適添加量為2.50 mg/g。

    2.1.8 MnSO4·H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    MnSO4·H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖8。

    圖8 MnSO4·H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.8 Effect of MnSO4·H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖8可知,不同添加量的MnSO4·H2O,對提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)MnSO4·H2O添加量為1.50 mg/g時,MK產(chǎn)量達到最大(219.29 mg/kg),與對照組的差異達到極顯著水平(P<0.01),比對照組的MK產(chǎn)量提高了107.6%;當(dāng)MnSO4·H2O的添加量為0~1.50mg/g時,隨著MnSO4·H2O添加量的升高,叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。這與Lin等[38]的研究結(jié)果一致,推測Mn2+可以通過促進MK生物合成途徑中莫納可林J和2-甲基丁酸前體的積累來促進MK的生成。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的MnSO4·H2O最佳添加量為1.50 mg/g。

    2.1.9 Na2MoO4·2H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    Na2MoO4·2H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖9。

    圖9 Na2MoO4·2H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.9 Effect of Na2MoO4·2H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖9可知,不同添加量的Na2MoO4·2H2O,對提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)Na2MoO4·2H2O的添加量為1.00 mg/g時,MK產(chǎn)量達到最大(326.91 mg/kg),與對照組的差異達到極顯著水平(P<0.01),比對照組的MK產(chǎn)量提高了133.3%;當(dāng)Na2MoO4·2H2O添加量小于1.00 mg/g時,隨著Na2MoO4·2H2O添加量的增加,叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。分析其原因,可能是Mo6+具有與Zn2+相似的功能,能夠促進聚酮化合物合成反應(yīng)的進行,進而提高紅曲霉的MK產(chǎn)量[39],此外,添加Na2MoO4·2H2O能夠減少叢毛紅曲霉在發(fā)酵過程出現(xiàn)的結(jié)塊現(xiàn)象,也有助于叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的提高。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,Na2MoO4·2H2O的最適添加量為1.00 mg/g。

    2.1.10 CaCl2對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    CaCl2添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見圖10。

    圖10 CaCl2添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.10 Effect of CaCl2concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖10可知,添加1.50 mg/g的CaCl2,能顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量,比對照組的MK產(chǎn)量提高了53.1%;當(dāng)CaCl2添加量小于1.50 mg/g時,隨著CaCl2添加量的升高,叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加;當(dāng)添加量高于1.50 mg/g時,MK產(chǎn)量隨著CaCl2添加量的增大而減小,且與對照組的MK產(chǎn)量無顯著差異(P>0.05)。分析原因可能是較高的CaCl2添加量不利于叢毛紅曲霉的生長,進而導(dǎo)致其MK產(chǎn)量下降[28]。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,CaCl2的最適添加量為1.50 mg/g。

    2.1.11 CoCl2·6H2O對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

    CoCl2·6H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)產(chǎn)MK的影響見圖11。

    圖11 CoCl2·6H2O添加量對叢毛紅曲霉固態(tài)產(chǎn)MK的影響Fig.11 Effect of CoCl2·6H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

    由圖11可知,CoCl2·6H2O添加量為0.05 mg/g時,可顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量,MK產(chǎn)量可達152.41 mg/kg,比對照組的MK產(chǎn)量提高了39.3%;當(dāng)CoCl2·6H2O添加量大于0.05 mg/g時,MK產(chǎn)量隨CoCl2·6H2O添加量的增加而逐漸減少。分析其原因,適當(dāng)添加Co2+,對叢毛紅曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)起到了促進作用,會顯著促進其菌絲生長和次生代謝產(chǎn)物的合成[35];但CoCl2·6H2O添加量過高時,反而抑制叢毛紅曲霉的菌絲生長。因此,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時,CoCl2·6H2O添加量不宜超過0.05 mg/g。

    2.2 固態(tài)發(fā)酵外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

    2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果分析

    以ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O和Na2MoO4·2H2O 3種誘導(dǎo)物為試驗因素,基于Box-Behnken試驗設(shè)計,以MK產(chǎn)量為響應(yīng)值,進行二次多項回歸方程擬合及分析,試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

    表2 外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 2 The results of response surface optimization for the optimal combination of inducers

    對數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸,得出二次多元回歸方程:Y=560.13-27.5A-22.22B+2.44C-36.96AB-20.29AC+30.87BC+28.92A2-95.43B2-23.92C2。同時,對回歸模型進行方差分析,結(jié)果如表3所示。

    表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results of regression model of response surface

    由表3可知,擬合方程的P<0.000 1,表明響應(yīng)面的回歸模型達到了極顯著水平;失擬項P=0.244 8>0.05,失擬不顯著,表明方程的擬合程度較好。因此,上述回歸方程可以用于準確分析和預(yù)測各因素與MK產(chǎn)量之間的關(guān)系?;貧w模型的確定系數(shù)R2=0.980 4,說明該模型能解釋98.04%響應(yīng)值的變化。因此,該模型擬合程度較好,能很好地反映響應(yīng)值的變化,可以利用此模型對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量進行分析和預(yù)測。

    此外,由回歸模型的方差分析結(jié)果(表3)可知,方程一次項中的A項、B項,交互項AB、BC項和二次項A2、B2、C2對叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響達到極顯著水平;交互項AC對叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響達到顯著水平。F值的大小能夠反映出各因素對MK產(chǎn)量的影響程度,根據(jù)F值可知,3種外源誘導(dǎo)物對叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響的大小順序為A(MnSO4·H2O)>B(Na2MoO4·2H2O)>C(ZnSO4·7H2O)。

    根據(jù)回歸擬合方程,做每2個因素對MK產(chǎn)量影響程度的響應(yīng)面三維圖,并對3組對比因素(AB、AC與BC)進行響應(yīng)面模擬分析,結(jié)果見圖12。

    圖12 各因素交互作用對MK產(chǎn)量的影響Fig.12 Interactive effects of variables on MK yield

    如圖12所示,BC圖形的曲面向上凸起,表明了在兩因素的影響下,存在最大值。AB與AC的兩兩因素之間交互作用的顯著性較弱,而BC的兩兩因素間交互作用的顯著性較強。

    2.2.2 外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的預(yù)測及驗證

    通過回歸模型的預(yù)測,當(dāng)MnSO4·H2O添加量為1.20 mg/g、Na2MoO4·2H2O 添加量為 1.00 mg/g、ZnSO4·7H2O添加量為2.80 mg/g,在此條件下,叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量預(yù)測值為622.25 mg/kg。為驗證模型預(yù)測的可靠性,根據(jù)預(yù)測的3種外源誘導(dǎo)物最佳添加量組合,進行3次平行試驗,其MK產(chǎn)量平均為631.10 mg/kg,與預(yù)測的MK產(chǎn)量無顯著差異,說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的參數(shù)可靠。

    3 結(jié)論

    該試驗研究了11種外源誘導(dǎo)物對叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,在適當(dāng)?shù)奶砑恿肯拢?1種外源誘導(dǎo)物對叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量都有一定的提高效果,其中,ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和Na2MoO4·2H2O 3種誘導(dǎo)物對MK產(chǎn)量的提高效果最顯著,分別比對照組提高了1.4倍、1.1倍、1.3倍。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明,外源誘導(dǎo)物的最優(yōu)組合為1.20 mg/g MnSO4·H2O、1.00 mg/g Na2MoO4·2H2O 和 2.80 mg/g ZnSO4·7H2O,其 MK 產(chǎn)量可達 631.10 mg/kg,與回歸方程預(yù)測的MK產(chǎn)量無顯著差異。

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