大蒜多肽提取工藝的優(yōu)化及其體外活性的測定

劉錦良，沈衡平，劉輝，范麗霞，楊安平，葉連寶*

（1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2.歐露蓮生物科技（廣東）有限公司，廣東 佛山 528051；3.佛山科學技術學院，廣東 佛山 528000）

大蒜為百合科蔥屬植物蒜（Allium sativum L.）的鱗莖，是日常生活中最常見的藥食兩用的植物之一?？捎糜谥委煼谓Y核、食欲不振、消化不良、痢疾、腸炎等疾病[1-2]。大蒜含有豐富的含硫有機化合物[3]，此外還含有蛋白質、揮發(fā)油和微量元素等[4]。研究表明大蒜具有抗氧化[5]、抗菌[6]、提高機體免疫力[7]、預防和治療癌癥的作用[8]。

多肽一般是指由幾個到多個氨基酸通過肽鍵連接起來的一類具有生物活性的化合物，也是蛋白質水解的中間產(chǎn)物[9]。研究表明，多肽在降血壓、抗氧化、降血脂、護膚等方面均具有較好的活性[10]。許新月[11]運用超聲輔助酶法制備的杏鮑菇多肽具有血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性，可用于治療高血壓。李文慧等[12]運用酶法提取的葡萄籽多肽具有較好的抗氧化能力。張囡[13]制備的香菇柄多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌均具有抑菌作用。

目前關于大蒜的研究主要集中在蒜氨酸、大蒜素等成分[14-15]。關于大蒜多肽的研究鮮有報道[16]。本試驗擬通過酶解法提取大蒜多肽，采用單因素試驗、響應面法優(yōu)化大蒜多肽的提取工藝，并對大蒜多肽的抗氧化能力及其對酪氨酸酶的抑制率進行測定，為進一步開發(fā)利用大蒜提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：市售；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雙縮脲試劑、復合蛋白酶（120 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、酪氨酸酶（500U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、維生素C（vitamin C，VC）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：廣東光華科技股份有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所；硫酸亞鐵：安吉豪森藥業(yè)有限公司；水楊酸：天津市光復精細化工研究所。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UNIQUE-R40型超純水儀：廈門銳思捷水純化技術有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機：金壇市醫(yī)療儀器廠；DF-101T型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；DZKW-S-8型恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海錦幻儀器儀表有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Varioskan Flash型多功能酶標儀：美國賽默飛世爾科技公司；V-1100D型紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

參考文獻[17]的方法，稱取大蒜100.0 g，在微波900 W條件下加熱5 min破壞蒜氨酸酶后備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

參考文獻[18]的方法，精密稱取牛血清白蛋白，加入超純水配制成濃度為10 mg/mL的標準蛋白溶液，然后加入超純水進行倍半稀釋，得到濃度為5.000、2.500、1.250、0.625、0.313 mg/mL 和 0.156 mg/mL 的系列牛血清白蛋白溶液，取上清液，吸取20μL上清液置于96孔板中，加入200 μL雙縮脲試劑，在37℃下反應30 min后，在540 nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y＝0.013x-0.001，R2＝0.998。

1.3.3 大蒜多肽的提取與測定

取2.0 g微波處理后的大蒜，置于組織搗碎勻漿機內，加入30 mL純化水，搗碎2 min，制備勻漿，加入1.5%的復合蛋白酶在pH7.0、50℃條件下酶解2.5 h，5 000 r/min離心10 min，吸取20 μL上清液置于96孔板中，加入200 μL雙縮脲試劑，在37℃下反應30 min后，在540 nm處測吸光度，根據(jù)1.3.2中所得回歸方程，計算大蒜多肽提取量。

1.3.4 單因素試驗

參考文獻[19]的方法，以2.0 g大蒜為基準，料液比1∶10（g/mL）、復合酶添加量 1.5%、pH7.0、50℃和酶解時間2.5 h為基準條件，固定其他因素及相應的水平，分別考察料液比 [1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、復合酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）對大蒜多肽提取量的影響。

1.3.5 響應面法優(yōu)化提取工藝

參考文獻[20]的方法，使用Design-Expert 8.0軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以大蒜多肽提取量為響應值，通過響應面分析對提取條件進行優(yōu)化，選擇出大蒜多肽提取量最高的提取條件為最佳提取工藝。響應面因素水平見表1。

表1 響應面因素水平Table 1 Response surface factor level

1.3.6 大蒜多肽的活性測定

1.3.6.1 大蒜多肽對DPPH自由基清除率的測定

將大蒜多肽用超純水配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的系列溶液，參考文獻[21]的方法，略有改動。于96孔板中分別加入100 μL大蒜多肽溶液、100 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液，25℃下避光反應30 min，在517 nm處測吸光度，記為A1。用等體積超純水代替DPPH溶液測定吸光度，記為A2，用等體積超純水代替大蒜多肽溶液，測定吸光度，記為 A3；維生素 C（VC）作為陽性對照。每組試驗重復3次，取平均值。

式中：A1為大蒜多肽液與DPPH混合液的吸光度；A2為大蒜多肽液與超純水混合液的吸光度；A3為DPPH與超純水混合液的吸光度。

1.3.6.2 大蒜多肽總抗氧化能力的測定

將大蒜多肽用超純水配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的系列溶液，按照總抗氧化能力測定試劑盒說明書方法，進行總抗氧化能力測定試驗。VC作為陽性對照。每組試驗重復3次，取平均值。

1.3.6.3 大蒜多肽對羥基自由基清除率的測定

將大蒜多肽用超純水配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的系列溶液，參考文獻[22]的方法，取5支試管，分別加入 1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇，混勻，再分別加入1 mL不同濃度的大蒜多肽溶液，最后加1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，于37℃下反應30 min，以超純水為參比，在510 nm處測定吸光度。由于大蒜多肽本身有一定的吸光度，以1mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇和1 mL不同濃度的大蒜多肽作為待測溶液的本底吸光度。VC作為陽性對照。每組試驗重復3次，取平均值。

式中：A1為空白對照液的吸光度；A2為加入大蒜多肽溶液后的吸光度；A3為不加顯色劑H2O2的待測溶液本底的吸光度。

1.3.6.4 大蒜多肽對酪氨酸酶抑制率的測定

將大蒜多肽用超純水配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的系列溶液，參考文獻[23-24]的方法，略有改動。按照表2加樣結束后，于37℃水浴下恒溫反應10 min，各加入0.2 mL酪氨酸酶溶液，反應20 min，迅速移入比色皿中，用紫外可見分光光度計在475 nm處測定各體系的吸光度。以熊果苷作為對照。每組試驗重復3次，取平均值。

表2 大蒜多肽抑制酪氨酸酶活性的反應體系Table 2 The reaction system of inhibition of garlic peptides on tyrosinase mL

式中：A、B、C、D分別為表中各反應體系反應結束后在475 nm處的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗中每組試驗重復3次，單因素考察用Graph－Pad Prism 8.0作圖，響應面法用Design Expert 8 Box-Behnken分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對大蒜多肽提取量的影響

料液比對大蒜多肽提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對大蒜多肽提取量的影響Fig.1 The effect of soil-liquid ratio on the extraction efficiency of garlic peptides

由圖1可知，隨著溶劑體積的增加，大蒜多肽提取量先上升后下降。在料液比為 1∶10（g/mL）～1∶15（g/mL）時大蒜多肽提取量升高，在料液比為1∶15（g/mL）到1 ∶30（g/mL）時提取量逐漸下降，當料液比為 1∶15（g/mL）時，大蒜多肽提取量達到最大，這可能是由于當溶劑體積過少時，不利于多肽的徹底溶解，而溶劑體積過多時，其他雜質也會溶出，從而影響多肽的溶出。因此，確定提取大蒜多肽的最佳料液比為1∶15（g/mL）。

2.1.2 復合酶添加量對大蒜多肽提取量的影響

復合酶添加量對大蒜多肽提取量的影響見圖2。

圖2 復合酶添加量對大蒜多肽提取量的影響Fig.2 The effect of compound proteinase addition on the extraction efficiency of garlic peptides

由圖2可知，隨著復合酶添加量的增加，大蒜多肽提取量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢。在復合酶添加量為0.5%～2.0%時，大蒜多肽提取量迅速增加，而復合酶添加量在2.0%～2.5%時，大蒜多肽提取量開始下降，復合酶添加量為2.0%時，大蒜多肽提取量達到峰值，這是因為隨著酶添加量的增加，反應速度加快，而酶添加量繼續(xù)增加時，由于底物逐漸減少，大蒜多肽提取量呈下降趨勢。因此，確定提取大蒜多肽的最佳復合酶添加量為2.0%。

2.1.3 pH值對大蒜多肽提取量的影響

pH值對大蒜多肽提取量的影響見圖3。

圖3 pH值對大蒜多肽提取量的影響Fig.3 The effect of pH value on the extraction efficiency of garlic peptides

由圖3可知，隨著pH值的增加，大蒜多肽提取量先上升后下降。在pH值為6.0～7.0時，兩者呈正相關，而在pH值為7.0～8.0時，大蒜多肽提取量呈下降趨勢，這是因為pH值過高或者過低均會影響酶的活性，從而影響大蒜多肽提取量。因此，確定提取大蒜多肽的最佳pH值為7.0。

2.1.4 溫度對大蒜多肽提取量的影響

溫度對大蒜多肽提取量的影響見圖4。

圖4 溫度對大蒜多肽提取量的影響Fig.4 The effect of temperature on the extraction efficiency of garlic peptides

由圖4可知，隨著溫度的增加，大蒜多肽提取量先升高后降低。在溫度為40℃～50℃時，大蒜多肽提取量逐漸升高，而溫度繼續(xù)升高時，大蒜多肽提取量迅速下降，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是溫度過高使酶的活性降低，同時較高的溫度破壞了部分浸出的多肽，從而使大蒜多肽提取量有所下降。因此，確定提取大蒜多肽的最佳溫度為50℃。

2.1.5 酶解時間對大蒜多肽提取量的影響

酶解時間對大蒜多肽提取量的影響見圖5。

圖5 酶解時間對大蒜多肽提取量的影響Fig.5 The effect of enzymatic time on the extraction efficiency of garlic peptides

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，大蒜多肽提取量先升高后下降。酶解時間為1.5 h～2.5 h時，大蒜多肽提取量逐漸升高，2.5 h時達到最大，而繼續(xù)延長酶解時間，大蒜多肽提取量開始下降，這可能是因為隨著酶解時間的延長，熱水致使部分多肽分解，導致大蒜多肽提取量有所降低，此外，酶解時間延長還可能會使溶解的雜質增多，從而使多肽的純度降低。因此，確定提取大蒜多肽的最佳酶解時間為2.5 h。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗結果的基礎上，選擇對大蒜多肽的提取量影響較大的料液比（A）、復合酶添加量（B）、酶解時間（C）3個因素，以大蒜多肽的提取量為響應值，根據(jù)響應面分析方法，設計三因素三水平試驗方案，試驗設計方案共17個試驗點，12個為分析試驗，其余5個為中心試驗（用于估算試驗誤差）。響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Experiments design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

試驗結果進行多元擬合回歸，得到以大蒜多肽提取量（Y）為因變量，以料液比（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）為自變量的回歸方程為Y=37.10-2.35A+2.43B+0.42C-0.73AB-4.13AC+1.03BC-12.21A2-6.01B2-8.01C2。

回歸方程方差分析見表4。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

由表4可知，回歸模型P＜0.000 1，水平為極顯著，能夠正確反映大蒜多肽提取量與各因素之間的關系，失擬項P值為0.746＞0.05，表示差異不顯著，說明回歸模型與實際試驗擬合較好，多元相關系數(shù)R2=0.980，表明實測值和預測值間有很好的擬合度。由P值可知，A為顯著因素，B、AC、A2、B2、C2為極顯著，說明料液比、復合酶添加量均對大蒜多肽提取量有較大影響。根據(jù)F值大小，可知影響因素的主次順序為復合酶添加量（B）＞料液比（A）＞酶解時間（C）。方差分析結果顯示，該回歸模型可用于大蒜多肽提取試驗。

2.2.3 響應面和等高線圖結果

各試驗因素交互作用的響應面及等高線圖見圖6。

圖6 各試驗因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由圖6可知，料液比與酶解時間之間的響應面曲面圖較陡峭，等高線呈橢圓形，交互作用極顯著（P＜0.01），對大蒜多肽提取量的影響較大，與表4方差分析結果一致。

2.2.4 最佳工藝的確定及驗證試驗

根據(jù)軟件分析，得最優(yōu)工藝組合為料液比為1 ∶14.43（g/mL）、加酶量為 2.11%、pH 值為 7.0、溫度為50℃、酶解時間為2.54 h，預測響應值為37.5 mg/g。為檢驗響應面法的可靠性，采用最優(yōu)工藝組合進行試驗證明，基于試驗操作的可行性，選取料液比為1∶15（g/mL）、復合酶添加量為2.0%、pH值為7.0、溫度為50℃、酶解時間為2.5h，試驗重復3次，得到的響應值分別為35.5、36.3、35.6 mg/g，平均值為35.8 mg/g，是理論值的 95.5%，十分接近預測值，符合要求。

2.3 大蒜多肽的活性測定

2.3.1 大蒜多肽對DPPH自由基的清除率

大蒜多肽對DPPH自由基的清除率見圖7。

圖7 大蒜多肽對DPPH自由基的清除率Fig.7 The clearance ratio of garlic peptides on DPPH radical

由圖7可知，大蒜多肽和VC對DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而增強，當大蒜多肽濃度為10 mg/mL時清除率為73.8%，VC濃度為10 mg/mL時清除率為97.1%。大蒜多肽清除DPPH自由基的IC50值為4.54 mg/mL。結果表明，大蒜多肽對DPPH自由基的清除率與VC相比較低，且隨著濃度增加，清除率與VC越來越接近。

2.3.2 大蒜多肽的總抗氧化能力

大蒜多肽的總抗氧化能力見圖8。

圖8 大蒜多肽的總抗氧化能力Fig.8 The total antioxidant capacity of garlic peptides

由圖8可知，當大蒜多肽濃度為10 mg/mL時總抗氧化能力為747.6 U/mg；對比VC濃度為10 mg/mL時總抗氧化能力為1 654.3 U/mg。大蒜多肽總抗氧化能力的IC50值為5.86 mg/mL。結果表明，大蒜多肽具有一定的總抗氧化能力，但隨著大蒜多肽濃度的增加總抗氧化能力與VC的差距逐漸增大。

2.3.3 大蒜多肽對羥基自由基的清除率

大蒜多肽對羥基自由基的清除率見圖9。

圖9 大蒜多肽對羥基自由基的清除率Fig.9 The clearance ratio of garlic peptides on OH·radical

由圖9可知，在大蒜多肽濃度為2 mg/mL～10 mg/mL時，羥基自由基的清除率為34.6%～64.5%；當VC濃度為10 mg/mL時清除率為98.1%。大蒜多肽清除羥基自由基的IC50值為5.81 mg/mL。結果表明，大蒜多肽對羥基自由基有一定的清除能力，與VC相比其對羥基自由基清除率較低。

2.3.4 大蒜多肽對酪氨酸酶的抑制率

大蒜多肽對酪氨酸酶的抑制率見圖10。

圖10 大蒜多肽對酪氨酸酶的抑制率Fig.10 The inhibition ratio of garlic peptides on tyrosinase

由圖10可知，當大蒜多肽濃度在2mg/mL～10mg/mL時，其對酪氨酸酶的抑制率在17.6%～48.1%之間；當熊果苷濃度為10 mg/mL時抑制率為90.6%。大蒜多肽抑制酪氨酸酶的IC50值為3.51 mg/mL。結果表明，熊果苷表現(xiàn)出更強的酪氨酸酶抑制能力，但大蒜多肽對酪氨酸酶仍具有一定的抑制能力。

3 結論

采用響應面法優(yōu)化酶解法提取大蒜多肽的最佳提取條件為料液比1∶15（g/mL）、復合蛋白酶添加量2.0%、pH7.0、50℃、酶解時間2.5 h，提取量為 35.8 mg/g。大蒜多肽清除DPPH自由基、總抗氧化能力和清除羥基自由基的 IC50值分別 4.54、5.86、5.81 mg/mL，抑制酪氨酸酶活性的IC50值為3.51 mg/mL。與其他植物多肽相比，其DPPH自由基清除率高于其它植物多肽。試驗結果表明，大蒜多肽具有較好的抗氧化活性，可作為抗氧化劑在食品中廣泛應用。