鄧成林,王芙苡,周金萍,相君,朱鄭惠,徐巽,林秋葉
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)
中國(guó)是茶的國(guó)度,也是茶文化的起源地[1]。茶憑借其健康、營(yíng)養(yǎng)、快捷等特點(diǎn),深受廣大消費(fèi)者青睞與歡迎,茶是世界上消費(fèi)量?jī)H次于水的飲料,全球約有2/3人口喝茶[2]。茶是一種具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的沖泡類飲品,含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[3-4]。大量研究表明,長(zhǎng)期飲用茶能降低癌癥、心血管疾病、糖尿病和帕金森病等慢性疾病的發(fā)病率[5],且飲茶還具有解渴消食、祛痰、解熱、利尿等功效[6]。茶葉中的茶多酚是一種抗氧化物質(zhì),具有良好的抗衰老、抗癌作用,且能夠有效預(yù)防糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)性疾病等病癥的發(fā)生[3,7]。此外,研究證實(shí)茶葉中的多糖、咖啡堿等植物活性成分具有增強(qiáng)免疫力、預(yù)防心血管疾病、降血壓、抗血栓等保健功能[8-10]。
隨著人們生活水平的提高,越來(lái)越多的消費(fèi)者追求口感更佳、便捷且具有保健功效的茶飲品[11]。茶飲料的制備對(duì)茶葉原料等級(jí)要求不高,茶飲料作為茶葉消費(fèi)的新興渠道,具有成本低、口感豐富及綠色健康等特點(diǎn),已成食品行業(yè)研究熱點(diǎn)之一[12]。目前,國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上銷售的茶飲料,以奶茶、果味茶、氣泡茶等調(diào)味茶飲料為主。發(fā)酵茶飲料是以茶葉浸提液為主要基質(zhì),通過(guò)微生物的生理代謝作用改善茶葉品質(zhì),使得茶飲料呈現(xiàn)出更多的口味和更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一類能夠利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、乳酸菌素、胞外多糖等的無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[14]。乳酸菌不僅可以促進(jìn)酸類、醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)提高發(fā)酵食品品質(zhì),而且是主要的益生菌種類,具有調(diào)節(jié)胃腸道健康、促進(jìn)免疫等多種生理功效[15-16]。幾項(xiàng)研究結(jié)果表明,植物乳桿菌在添加茶提取物的MRS肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好[17-18],同時(shí)植物乳桿菌發(fā)酵茶提取物增加了兒茶素的含量和抗氧化生物活性[19]。目前,乳酸菌發(fā)酵茶飲料主要集中在風(fēng)味和穩(wěn)定性研究[20-21],益生乳酸菌發(fā)酵茶飲料及其生物學(xué)功效的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,研發(fā)集益生乳酸菌與茶葉保健功效于一體的新型茶葉制品具有重要意義。
本研究以綠茶浸提液為原料,以自主分離的具有優(yōu)良益生特性的植物乳桿菌ST為菌種,采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料進(jìn)行工藝優(yōu)化,并評(píng)價(jià)最佳工藝條件下發(fā)酵綠茶飲料的體外抗氧化活性以及貯藏過(guò)程中品質(zhì)變化情況,旨在為微生物發(fā)酵茶飲料新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定理論依據(jù),研究結(jié)果對(duì)于促進(jìn)茶葉資源的合理應(yīng)用和拓展茶產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)具有重要意義。
綠茶茶葉:市售;植物乳桿菌ST:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌課題組從發(fā)酵食品中自主分離獲得,保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”,保藏號(hào)為CGMCC NO.13911。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]:美國(guó) Sigma-Aldrich 公司;MRS 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉、CaCl2、NaHCO3、NaCl、碳酸鈣:美倫生物科技有限公司;液體石蠟、無(wú)水乙醇、異丙醇:成都市科隆化學(xué)品有限公司;氯仿:重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;六偏磷酸鈉、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)、β-環(huán)狀糊精、黃原膠:佳力士添加劑(海安)有限公司;蔗糖:昆明多悅多工貿(mào)有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋:日本三菱MGC公司。以上試劑均為分析純。
721紫外分光光度計(jì):云南賽恩斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZX-50L立式高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺(tái):蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司;PHS-3C pH計(jì):上海雷磁儀器廠;GRX-9203A微生物恒溫培養(yǎng)箱:上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL-16G高速低溫離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.4.1 工藝流程
1.4.2 操作要點(diǎn)
1.4.2.1 茶葉浸提液的制備
稱取5 g綠茶茶葉置于1 000 mL蒸餾水中,于90℃~95℃條件下浸提20 min,用180目篩過(guò)濾即得茶葉浸提液。
1.4.2.2 調(diào)配均質(zhì)
將0.05%六偏磷酸鈉、0.3%β-環(huán)狀糊精、0.04%黃原膠、0.04%CMC以及6.6%蔗糖添加到茶葉浸提液中并混勻。將上述調(diào)配好的茶葉浸提液于20 MPa~30 MPa條件下均質(zhì)3 min~5 min。
1.4.2.3 灌裝殺菌
將上述調(diào)配均質(zhì)后的茶湯分裝于250 mL玻璃飲料瓶中,每瓶200 mL,于62℃~65℃滅菌30 min,作為綠茶飲料發(fā)酵基液。
1.4.2.4 接菌發(fā)酵
向上述綠茶發(fā)酵基液中接種植物乳桿菌ST 7 lg(CFU/mL),于 38.7 ℃下發(fā)酵 17 h,即得發(fā)酵綠茶飲料。
1.4.3 乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料工藝優(yōu)化
1.4.3.1 乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料單因素試驗(yàn)
以接種量7 lg(CFU/mL)、加糖量6%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間24 h為綠茶飲料基礎(chǔ)發(fā)酵條件,以植物乳桿菌 ST 接種量 4、5 、6、7、8 lg(CFU/mL),加糖量2%、4%、6%、8%、10%,發(fā)酵時(shí)間 6、9、12、15、18、21、24 h,發(fā)酵溫度 31、33、35、37、39、41、43 ℃為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn),考察各因素對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料感官品質(zhì)和抗氧化活性的影響。
1.4.3.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵茶飲料最佳工藝條件
依據(jù)單因素試驗(yàn)確定不同因素的影響程度,選取接種量(A)、加糖量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)4個(gè)因素為考察對(duì)象,以感官評(píng)分(E)為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用Design-Expert V8.0.6軟件,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。
表1 發(fā)酵綠茶飲料的試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface design forfermentation of green tea beverage
1.4.4 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
根據(jù)GB/T 21733—2008《茶飲料》的相關(guān)規(guī)定,由具有一定專業(yè)知識(shí)及良好口感敏銳性的5男5女組成10人感官評(píng)定小組對(duì)發(fā)酵綠茶飲料進(jìn)行嚴(yán)格打分,感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[22]。
表2 植物乳桿菌ST發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of Lactobacillus plantarum ST-fermented green tea beverage
1.4.5 植物乳桿菌ST發(fā)酵綠茶飲料抗氧化活性分析
1.4.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)方法[23-25]進(jìn)行DPPH自由基清除率的測(cè)定。取1 mL發(fā)酵綠茶飲料上清液(4 000 r/min,15 min)加入到1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中,振蕩搖勻,25℃避光靜置30 min,于517 nm處測(cè)吸光度,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次(取平均值記為A樣)。另取2 mL未加樣品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,振蕩搖勻,25℃避光靜置30 min,于517 nm處測(cè)其吸光度,記為A0。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。
式中:A樣為1 mL樣品+1 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A0為加樣品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度。
1.4.5.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)方法[26-27]進(jìn)行ABTS+自由基清除能力測(cè)定。在734 nm處將ABTS+儲(chǔ)備液用pH7.4磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)吸光度至0.70±0.02,即為ABTS+反應(yīng)試液。取2 mL ABTS+反應(yīng)試液,加入20 μL發(fā)酵綠茶飲料上清液(4 000 r/min,15 min)并混勻,避光靜置6 min后于734 nm處測(cè)吸光度,平行測(cè)定3次(取平均值記為A樣),同時(shí)取2.02 mL ABTS+反應(yīng)試液,避光靜置6 min后于734 nm處測(cè)吸光度(記為A0)。取2 mL溶劑(去離子水),加入20 μL樣品溶液并混勻,避光靜置6 min后于734 nm處測(cè)其吸光度(記為A對(duì))。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。
式中:A樣為 20 μL 樣品+2 mLABTS+反應(yīng)試液的吸光度;A0為 2.02 mLABTS+反應(yīng)試液吸光度;A對(duì)為 20 μL樣品+2 mL溶劑(去離子水)的吸光度。
1.4.6 植物乳桿菌ST發(fā)酵綠茶飲料貯藏期內(nèi)品質(zhì)變化
按照1.4.1制備乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料,測(cè)定在4℃條件下貯藏 1、3、5、7、14、21 d 的感官評(píng)分、pH 值、乳酸菌總數(shù)、茶多酚含量、咖啡堿含量和DPPH自由基清除率以及ABTS+自由基清除率。乳酸菌活菌數(shù)參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定;茶多酚含量參照GB/T 21733—2008《茶飲料》進(jìn)行測(cè)定;咖啡堿含量參照GB/T 5009.139—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料中咖啡因的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定;pH值利用pH計(jì)測(cè)定。
數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Ducan法進(jìn)行多重比較,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著水平設(shè)置P<0.05。
2.1.1 植物乳桿菌ST接種量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響
接種量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分和自由基清除率的影響見(jiàn)圖1。
圖1 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of Lactobacillus plantarum ST on fermented green tea beverage
由圖1可知,隨著植物乳桿菌ST接種量的增加,發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分先緩慢上升后急劇下降,分析可能是由于乳酸菌接種量過(guò)低,產(chǎn)酸少、發(fā)酵風(fēng)味不足;而接種量過(guò)高,產(chǎn)酸過(guò)多,導(dǎo)致產(chǎn)品口感較差、接受度差。接種量為7 lg(CFU/mL)時(shí),發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分和抗氧化活性均最高。因此,選取植物乳桿菌ST的最佳接種量為7 lg(CFU/mL)。
2.1.2 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響
加糖量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分和自由基清除率的影響見(jiàn)圖2。
圖2 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響Fig.2 Effect of sucrose addition on fermented green tea beverage
由圖2可知,隨著加糖量的增加,發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分和抗氧化活性均先緩慢上升再緩慢下降。加糖量低于6%時(shí),感官評(píng)分隨著加糖量的增加緩慢升高,高于6%時(shí),感官評(píng)分有所下降,原因是蔗糖添加過(guò)多,口感過(guò)于甜膩。加糖量為6%時(shí),綠茶飲料的風(fēng)味較好,酸甜適中,此時(shí)DPPH自由基清除率最高,ABTS+自由基清除率較高。因此選取發(fā)酵綠茶飲料的最適加糖量為6%。
2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響
發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分和自由基清除率的影響見(jiàn)圖3。
圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響Fig.3 Effect of fermentation time on fermented green tea beverage
由圖3可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分先上升后急劇下降,18 h時(shí)感官評(píng)分最高,18 h后感官評(píng)分急劇下降,這可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)酸過(guò)多而影響產(chǎn)品的口感和風(fēng)味,且發(fā)酵18 h時(shí)的DPPH自由基清除率最高,ABTS+自由基清除率接近最大值。綜合分析,選取發(fā)酵綠茶飲料的最適發(fā)酵時(shí)間為18 h。
2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響
發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分和自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。
圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵綠茶飲料的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on fermented green tea beverage
由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分呈先緩慢上升后緩慢下降的趨勢(shì),發(fā)酵溫度為37℃~39℃時(shí),綠茶飲料感官評(píng)分最為理想,口感風(fēng)味最佳,DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率較高,溫度偏高或偏低可能均不利于菌株的生長(zhǎng),進(jìn)而影響產(chǎn)品風(fēng)味和抗氧化活性。綜合分析,選取發(fā)酵綠茶飲料的最適發(fā)酵溫度為38℃。
響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 發(fā)酵綠茶飲料的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage
續(xù)表3 發(fā)酵綠茶飲料的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage
運(yùn)用Design-Expert 8.0對(duì)表3中的感官評(píng)分進(jìn)行回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程:E=74.26-3.04A+3.81B+0.92C-0.90D+0.94AB-2.56AC-3.37AD-0.63BC-1.87BD-1.31CD-7.20A2-3.30B2-2.02C2-0.11D2。
對(duì)該響應(yīng)面模型進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果如表4所示。
表4 二次多項(xiàng)模型及各項(xiàng)的方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic multinomial models and items
由表4可知,模型P<0.000 1,說(shuō)明該模型極顯著。在模型中,A、B、AC、AD、BD、A2、B2和 C2項(xiàng)差異極顯著(P<0.01),C 和 D 項(xiàng)差異顯著(P<0.05);各發(fā)酵因素對(duì)感官評(píng)分的影響次序是B>A>C>D,即加糖量>接種量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間。相關(guān)系數(shù)R2=0.973 6,表明此模型的擬合度很好,能較好地描述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系,可以解釋97.36%的變化。R2Adj=0.947 2,說(shuō)明試驗(yàn)誤差小,可信度較高。因此,可用該模型來(lái)確定植物乳桿菌ST發(fā)酵綠茶飲料的最優(yōu)工藝。
各因素之間交互作用的等高線3D響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。
圖5 各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of effect of interaction of experimental factors on sensory quality of fermented green tea beverage
由圖5可知,AC、AD、BD之間交互作用明顯,且AD交互效果最好,三維立體圖響應(yīng)面的開(kāi)口朝下,表明響應(yīng)面具有最大值,在試驗(yàn)范圍內(nèi)有最優(yōu)配方。根據(jù)上述二次多項(xiàng)回歸方程可得,當(dāng)接種量為7.12 lg(CFU/mL)、加糖量為6.66%、發(fā)酵溫度為38.72℃、發(fā)酵時(shí)間為16.83 h時(shí),發(fā)酵綠茶飲料的感官評(píng)分達(dá)75.15。考慮到實(shí)際操作將上述工藝條件修正為接種量7 lg(CFU/mL)、加糖量 6.6%、發(fā)酵溫度 38.7℃、發(fā)酵時(shí)間17 h。在此工藝條件下進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)驗(yàn)證制備的乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料,得到的感官評(píng)分實(shí)際值為76.31,與模型預(yù)測(cè)值接近,證明此模型可靠。
抗氧化活性是茶多酚的主要功能活性之一,乳酸菌發(fā)酵對(duì)茶飲料抗氧化活性的影響見(jiàn)圖6。
圖6 乳酸菌發(fā)酵對(duì)綠茶飲料抗氧化活性的影響Fig.6 Antioxidant activity of fermented green tea beverage
由圖6可知,與未發(fā)酵相比,乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料的DPPH自由基和ABTS+自由基清除率顯著提高(P<0.05),其中,DPPH自由基清除率提高了10.34%,ABTS+自由基清除率提高了23.10%,表明利用乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料可以提高綠茶飲料的抗氧化活性。
乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料4℃貯藏21 d的品質(zhì)變化結(jié)果見(jiàn)圖7。
由圖7可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),感官評(píng)分先升高后降低,乳酸菌活菌數(shù)及茶多酚、咖啡因含量均逐漸降低,pH值則整體緩慢增加,分析可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境的緩沖作用[22],也可能是貯藏過(guò)程中發(fā)生了某種酯化反應(yīng)消耗了酸[28]。貯藏21 d時(shí),乳酸菌活菌數(shù)為6.30 lg(CFU/mL),pH值為3.42,茶多酚含量為1 002.98 mg/L,咖啡因含量為 193.58 μg/mL。貯藏過(guò)程中,發(fā)酵茶飲料無(wú)異味和分層,組織狀態(tài)略有沉淀,可能是由于茶多酚、咖啡因和蛋白質(zhì)的絡(luò)合沉淀作用[29]。上述結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料冷藏貨架期可達(dá)21 d。
本研究以植物乳桿菌ST接種量、加糖量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料的感官品質(zhì)及抗氧化活性進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料的工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到各因素對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料影響大小排序?yàn)榧犹橇浚窘臃N量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間。最佳工藝條件為接種量7 lg(CFU/mL)、加糖量6.6%、發(fā)酵溫度38.7℃、發(fā)酵時(shí)間17 h,該條件下,發(fā)酵綠茶飲料感官評(píng)分為76.31,植物乳桿菌ST活菌數(shù)均值為8.49 lg(CFU/mL),pH值為3.24,茶多酚含量為1 079.93 mg/L,咖啡因含量為 195.94 μg/mL,DPPH自由基、ABTS+自由基清除率分別為69.91%和42.29%,與未發(fā)酵相比均顯著增加(P<0.05)。對(duì)乳酸菌發(fā)酵綠茶飲料進(jìn)行4℃、21 d貯藏試驗(yàn),結(jié)果顯示,乳酸菌活菌數(shù)在 6 lg(CFU/mL)以上,pH 值在 3.24~3.42 之間,茶多酚含量為1 002.98 mg/L,咖啡因含量為193.58 μg/mL,在貯藏期內(nèi)飲料的風(fēng)味和口感穩(wěn)定。