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    低壓靜電場對凡納濱對蝦多酚氧化酶性質(zhì)影響

    2022-10-18 04:51:40李甜張珊李孟華吳夢蘭段昕辰林慧敏
    食品研究與開發(fā) 2022年19期

    李甜,張珊,李孟華,吳夢蘭,段昕辰,林慧敏

    (浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山 316021)

    凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是我國經(jīng)濟(jì)價值較高的對蝦品種之一,其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,深受消費者青睞。但捕撈失活后,凡納濱對蝦體表色素易沉著,即黑變,影響其感官品質(zhì)。盡管凡納濱對蝦輕微的黑變對健康無害,但卻極大地影響了對蝦的銷售質(zhì)量。對蝦的黑變是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)將酚類氧化生成醌類,醌類化合物與蛋白質(zhì)聚合,進(jìn)一步生成色素導(dǎo)致的[1]。蝦內(nèi)源性多酚氧化酶活性變化與黑變的發(fā)展密切相關(guān),因此,有效抑制多酚氧化酶的活性會延緩儲藏期間對蝦黑變[1]。冷凍儲藏可以防止蝦黑變,但傳統(tǒng)的冷凍方法可能會改變?nèi)饨M織中水分的含量和分布[2],從而導(dǎo)致大冰晶的形成,蝦的品質(zhì)發(fā)生變化,同時解凍產(chǎn)品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)也會發(fā)生過度氧化[3]。這些變化可能會大大降低蝦制品的質(zhì)量。因此,人們致力于開發(fā)新的冷凍方法以達(dá)到“冷凍保鮮”的目的,如高壓[4]、超聲[5]、磁場[6]、等離子體[7]和高壓靜電場[8],但這些方法往往成本高、不方便、不穩(wěn)定,短期內(nèi)難以大規(guī)模應(yīng)用于肉類加工。

    近年來,低壓靜電場已被證明是在冷凍過程中保存食品的有效方法,該方法易于實現(xiàn),適用于多種食品,且價格低廉[9]。Xie等[10]研究發(fā)現(xiàn)在牛扒冷凍過程中施加低壓靜電場,可以降低牛扒的汁液損失和質(zhì)構(gòu)損失。張珊等[11]研究發(fā)現(xiàn),低壓靜電場通過抑制蝦肉中腐敗微生物的生成,使對蝦pH值與揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)值、蒸煮損失率始終比對照組低,但該研究并未對蝦體內(nèi)的多酚氧化酶進(jìn)行研究報道。

    本文以凡納濱對蝦為研究對象,通過多酚氧化酶性質(zhì),如酶活性、表面疏水性、超微量Ca2+-三磷酸腺苷酶(Ca2+-adenosine triphosphatase,Ca2+-ATPase)活性、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis,SDS-PAGE)、圓二色譜在兩種貯藏條件下的差異性,研究微凍條件下低壓靜電場對凡納濱對蝦多酚氧化酶酶活性影響。本研究將為低壓靜電場(low voltage electrostatic field,LVEF)在對蝦冷凍貯藏中的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活凡納濱對蝦,購于舟山國際水產(chǎn)城,保溫箱中加冰充氧,30 min內(nèi)運送到實驗室,立即剔除死亡、不完整的個體后用純凈水沖洗2次,用碎冰將對蝦猝死,挑選個體差異不大、肢體完整、體表有光澤的對蝦作為研究樣品,用冰水(0℃~4℃)清洗后瀝干。

    SDS-PAGE試劑盒(包括蛋白上樣緩沖液、凝膠快速配制試劑):上海碧云天生物技術(shù)有限公司;R250考馬斯亮藍(lán)染色液:武漢谷歌生物科技有限公司;寬分子量蛋白質(zhì)Marker:美國Thero Scientific公司;pH8.0的20 mmol/LTris-HCl溶液、固體硫酸銨、pH6.5磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)、溴酚藍(lán)指示劑(均為分析純)、Ca2+-ATPase活性試劑、巰基試劑盒、總蛋白試劑盒:南京建成生物工程研究所。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BX-2000型靜電場裝置:浙江馳力科技股份有限公司;Eppendorf 5425R高速冷凍離心機(jī):賽默飛世爾科技(中國)有限公司;PHS-25型酸度計:梅特勒托利多公司;FSH-2型可調(diào)高速勻漿機(jī):常州國華電器有限公司;DZF-150真空冷凍干燥箱:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;UV5900紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;JASCO-J-720CD光譜偏振儀:北京市六一儀器廠。

    1.3 低壓靜電場裝置及試驗分組

    低壓靜電場裝置:本試驗的靜電場裝置由靜電場發(fā)生裝置和放電板組成,其中靜電場發(fā)生裝置為AC220 V、50/60 Hz,放電板(140 mm×120 mm)在冰箱(-7℃)內(nèi)產(chǎn)生低壓靜電場,形成負(fù)離子環(huán)境,放電板垂直放置,試驗樣品與放電板平行確保物料不與放電板直接接觸,靜電場發(fā)生裝置輸出電壓為2 500 V、電流為0.2 mA。靜電場環(huán)境模擬圖見圖1。

    圖1 對蝦樣品在靜電場環(huán)境中的放置模擬圖Fig.1 Simulation of sample placement in LVEF

    試驗分組:將瀝干的對蝦樣品先裝入無菌密封袋中再放入保鮮盒內(nèi),一組為在低壓靜電場條件下貯藏的處理組,即LVEF組;一組為在冰箱中貯藏的對照組(Con組),兩組樣品儲藏溫度均為-7℃。將購買蝦的當(dāng)天記做試驗第0天,每4 d對蝦的各項指標(biāo)取樣檢測,試驗重復(fù)兩次、每個重復(fù)中各指標(biāo)分別進(jìn)行3次檢測。

    1.4 多酚氧化酶性質(zhì)研究

    1.4.1 多酚氧化酶的制備

    參考López-Caballero等[12]的多酚氧化酶的制備方法并略有改動。將LVEF組和Con組的凡納濱對蝦取出,在無菌密封袋封裝條件下用流水解凍,至半解凍狀態(tài)下時,取對蝦頭部并去除頭部外殼,取出完整的腦部組織20 g,用消毒過的剪刀將腦組織剪碎成小塊肉粒,按 1∶4(g/mL)向蝦腦組織中加入80 mLpH8.0、20 mmol/LTris-HCl,充分混合后在4℃下勻漿10min,然后在冰水中靜置3h,冷凍離心25min(4℃,8000r/min),取上清液,上清液中添加固體硫酸銨,(20±2)℃下靜置30 min,當(dāng)飽和度達(dá)到40%時,先進(jìn)行硫酸銨鹽析24 h再用20 mmol/LTris-HCl(pH8.0)作為透析液透析12 h,透析過程中每4 h需要更換一次透析液,透析完成后冷凍離心 10 min(4℃,4 000 r/min),所得上清液即為多酚氧化酶粗液,酶液冷凍保存于-80℃冰箱中備用。

    1.4.2 酶活性測定

    參考Xu等[13]多酚氧化酶活性測定方法并稍作修改。在離心管中加入1.0 mL、15 mmol/L的左旋多巴及pH6.5、1.6 mL、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液,再加入0.4 mL的酶液。充分混合后于37℃的水浴鍋中反應(yīng)3 min,而后在490 nm處測吸光值。根據(jù)多酚氧化酶作用于底物釋放的物質(zhì)在490 nm有最大吸光值來計算酶活性值,1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量稱為1酶單位(U),用A/(min·mL)表示。

    1.4.3 總巰基含量的測定

    參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶的總巰基含量。

    1.4.4 表面疏水性的測定

    參考梁慧等[14]多酚氧化酶表面疏水性的測定方法進(jìn)行測定,在20 μL、1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液中加入2 mL酶液并充分混勻。Con組直接在溴酚藍(lán)溶液加入2 mL的pH8.0、20 mmol/LTris-HCl緩沖液。在室溫(20±2)℃下充分振蕩10 min后在595 nm處測定其吸光值。表面疏水性的計算公式如下。

    1.4.5 總蛋白含量的測定

    參照試劑盒說明書測定總蛋白含量。

    1.4.6 Ca2+-ATPase活性的測定

    參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶Ca2+-ATPase活性。以每小時每毫克蛋白中三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase,ATPase)分解ATP所釋放的無機(jī)磷的量表示(U/mg prot)。

    1.4.7 SDS-PAGE測定

    多酚氧化酶首先用SDS-PAGE試劑盒中蛋白上樣緩沖液溶解(1∶1體積比混合),然后在95℃水浴下反應(yīng)20 min。電泳凝膠板厚1 mm,下層膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,上層膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,每次上樣量10 μL。電泳設(shè)置的電流為80 mV,電泳時間為3 h,當(dāng)樣品由上層膠進(jìn)入下層膠界面后立刻將電流調(diào)至120 mV。電泳結(jié)束后,用預(yù)先配制好的0.1%考馬斯亮藍(lán)染色液在培養(yǎng)皿中對膠片進(jìn)行染色,水平搖床染色30 min,用超純水沖洗3次后用含7%冰醋酸和5%甲醇的脫色液脫色至蛋白條帶清晰即可。

    1.4.8 圓二色譜的測定

    根據(jù)Zhou等[15]的方法進(jìn)行圓二色譜(circular dichromatography,CD)分析。在180 nm~260 nm即遠(yuǎn)紫外范圍內(nèi),以1 nm的帶寬和50 nm/min速度掃描18 CD光譜。每次處理后24 h內(nèi)掃描0.2 mL 1.0 mg/mL PPO。所有測得的CD光譜用pH6.5、50 mL磷酸鹽緩沖液進(jìn)行基線校正,PPO二級結(jié)構(gòu)的含量依據(jù)Dichroweb網(wǎng)站的SELCON3算法來計算。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    所有樣品進(jìn)行3次平行試驗,數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)作圖采用Origin 8.5軟件。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 LVEF對PPO酶活性的影響

    LVEF對PPO酶活性的影響見圖2。

    圖2 LVEF對PPO酶活性的影響Fig.2 Effect of LVEF on polyphenol oxidase activity

    由圖2可知,兩組PPO的酶活性變化趨勢相同。隨著貯藏時間的延長,都呈先上升后降低再上升的趨勢。貯藏0~4 d時小幅度增高,4 d~12 d時Con組酶活性從92.0 A/(min·mL)降為82.3 A/(min·mL),LVEF組從91.4 A/(min·mL)降到84.7 A/(min·mL)。對蝦死亡后,體內(nèi)糖原在無氧環(huán)境下發(fā)生糖酵解而產(chǎn)生大量酸類物質(zhì),pH值下降進(jìn)而影響了PPO的酶活性[16]。12 d后,PPO酶活性逐漸回升,原因是隨貯藏時間的延長而被逐漸激活。在24 d的貯藏試驗中,除12 d外,其余貯藏時間Con組酶活性高于LVEF組,這說明LVEF能夠有效抑制PPO的活性。

    2.2 LVEF對PPO總巰基的影響

    LVEF對PPO總巰基含量的影響見圖3。

    圖3 LVEF對PPO總巰基含量的影響Fig.3 Effect of LVEF on the content of thiol in polyphenol oxidase

    巰基一般指蛋白質(zhì)或多肽鏈上半胱氨酸殘基上的巰基基團(tuán),它在維持蛋白質(zhì)活性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上有重要作用。圖3顯示,隨著貯藏時間的延長,兩組樣品的總巰基含量整體呈下降趨勢。其中Con組PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結(jié)束時下降到0.071 5 mmol/g prot,LVEF組的PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結(jié)束時下降到0.021 1 mmol/g prot,分別下降了30.18%和79.39%,LVEF組的PPO的巰基含量下降更明顯。

    在體內(nèi)或者人工環(huán)境條件下,蛋白質(zhì)或多肽鏈上巰基和二硫鍵會相互轉(zhuǎn)化,這種轉(zhuǎn)化在一定程度上反映了蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的折疊和去折疊的互相轉(zhuǎn)化。由圖3可知,LVEF組樣品的巰基含量在整個貯藏過程中下降速度比Con組快,其原因可能是低壓靜電使得原本在PPO內(nèi)部的活性巰基基團(tuán)因蛋白酶空間折疊和去折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變而被暴露于表面,激化了化學(xué)反應(yīng)從而導(dǎo)致巰基含量顯著下降[17]。Jia等[18]在用高壓靜電場(high voltage electrostatic field,HVEF)解凍豬肉時發(fā)現(xiàn),HVEF組比對照組豬肉的肌原纖維蛋白的巰基含量明顯減少。這也顯示電場環(huán)境下蛋白空間構(gòu)象發(fā)生改變進(jìn)而使巰基含量改變。

    2.3 LVEF對PPO表面疏水性的影響

    蛋白表面疏水性是對蛋白質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)變化的一個敏感測量指標(biāo),被用于進(jìn)一步評估蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性。在LVEF條件下凡納濱對蝦PPO表面疏水性的變化如圖4所示。

    圖4 LVEF對PPO表面疏水性的影響Fig.4 Effect of LVEF on the surface hydrophobicity of PPO

    圖4顯示,在冷凍處理條件下,PPO分子被展開和拉伸,空間結(jié)構(gòu)變得松散,因此隨著貯藏時間的延長,兩組樣品的表面疏水性均呈上升趨勢。經(jīng)過24 d的貯藏,其中Con組對蝦樣品PPO表面疏水性從初始值的28.47 μg升高到 73.90 μg,而LVEF組對蝦樣品PPO表面疏水性則由初始值28.47 μg升高到85.10 μg,LVEF組升高較Con組明顯。在貯藏過程中因腐敗微生物代謝和生化反應(yīng)使蛋白質(zhì)變質(zhì),構(gòu)象破壞,蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,導(dǎo)致疏水性增加。而LVEF組的表面疏水性上升較Con組高的原因可能是靜電場釋放O3會使得蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。

    2.4 LVEF對PPO總蛋白的影響

    總蛋白含量是反映蛋白質(zhì)變性程度的一個重要指標(biāo)。對蝦在冷凍貯藏期間,腐敗微生物代謝及生物內(nèi)源酶會使對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)被逐漸分解,蛋白質(zhì)的構(gòu)象被破壞,因此總體蛋白含量下降。LVEF對PPO總蛋白的影響見圖5。

    圖5 LVEF對PPO總蛋白的影響Fig.5 Effect of LVEF on total protein of polyphenol oxidase

    圖5顯示,在24d的貯藏期間,兩組的總蛋白含量均呈下降趨勢,但Con組總蛋白含量下降速率較LVEF組更緩慢。LVEF組的總蛋白含量由初始值84.88 gprot/L降為42.48 gprot/L,Con組由84.81gprot/L降為58.87gprot/L。說明LVEF對于PPO的蛋白變性具有促進(jìn)作用。貯藏20 d后,LVEF處理加速了PPO的變性,蛋白質(zhì)變性成為總蛋白含量下降的主要原因,導(dǎo)致總蛋白呈“斷崖式”下降。

    2.5 LVEF對PPO的Ca2+-ATPase活性的影響

    不同貯藏方式下的PPO中Ca2+-ATPase活性差異如圖6所示。

    圖6 LVEF對Ca2+-ATPase的影響Fig.6 Effect of LVEF on Ca2+-ATPase

    由圖6可知,LVEF組的Ca2+-ATPase活性初始值為 0.064 2 U/mg prot,24 d 后僅為 0.022 7 U/mg prot;Con組的Ca2+-ATPase活性初始值為0.064 2U/mg prot,24 d后為0.042 8 U/mg prot。兩組在前期下降速度緩慢,但貯藏20 d時,Con組的Ca2+-ATPase下降速率較穩(wěn)定,而LVEF組則下降明顯,說明貯藏后期蛋白質(zhì)變性程度加劇,這與總蛋白含量的研究結(jié)果一致。Ca2+-ATPase活性可作為蛋白質(zhì)的變性指標(biāo),說明了LVEF會加速PPO蛋白變性。Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn),電場可以降低酯酶的活性,維持產(chǎn)品的質(zhì)量。

    2.6 SDS-PAGE測定結(jié)果

    PPO在兩種條件下貯藏的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。

    圖7 SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE analysis results

    由圖7的SDS-PAGE可知,PPO分子質(zhì)量約為210 kDa,這與 Nirmal等[19]結(jié)論相似。在 8、16、24 d 貯藏期間,LVEF組與Con組相比,各條帶色度和寬度均沒有出現(xiàn)明顯變化,即沒有觀察到PPO的降解。各組及各貯藏期間PPO分子質(zhì)量都在210 kDa,說明LVEF并不是通過降解PPO蛋白分子來影響酶活性。Xie等[17]在用LVEF解凍牛肉試驗研究中也發(fā)現(xiàn),LVEF不會影響蛋白分子質(zhì)量。

    2.7 PPO圓二色譜分析

    PPO圓二色譜分析見圖8,多酚氧化酶二級結(jié)構(gòu)比例見表1。

    圖8 多酚氧化酶圓二色譜分析Fig.8 Circular dichroism analysis of PPO

    表1 多酚氧化酶二級結(jié)構(gòu)比例Table 1 Secondary structure analysis of polyphenol oxidase

    圓二色譜中180 nm~260 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)可以反映蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的光活性基團(tuán)的肽鍵的分布區(qū)。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)反映的是蛋白質(zhì)分子的有序性,而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等則體現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子的無序性[20]。

    由圖8可知,α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜的線性疊加,兩組色譜圖均在220 nm處具有負(fù)峰,這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰,說明PPO中有多種構(gòu)象并存,并以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。

    由表1可知,LVEF處理后的PPO的α-螺旋及β-折疊含量減少,β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲含量相對增高,表明LVEF通過改變PPO的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊比例改變酶活性。

    3 結(jié)論

    本研究考察了LVEF對凡納濱對蝦PPO性質(zhì)的影響。除12 d外,其余貯藏時間LVEF組PPO酶活性低于Con組,兩組樣品的總巰基、總蛋白含量和Ca2+-ATPase活性總體呈下降的趨勢,但LVEF組樣品下降更為明顯,這說明LVEF有促進(jìn)PPO蛋白變性的作用;SDS-PAGE顯示PPO的分子量未發(fā)生明顯變化,這說明LVEF并不會斷裂PPO的分子鏈;CD譜和表面疏水性的檢測結(jié)果顯示LVEF可能是通過改變PPO的二級結(jié)構(gòu)來影響酶的活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),LVEF在凡納濱對蝦的微凍保鮮過程中可以通過抑制PPO酶的活性延長產(chǎn)品貨架期,這對于對蝦的儲運銷售具有指導(dǎo)意義,并為對蝦產(chǎn)品的儲運保鮮提供了新的思路。

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