低密度脂蛋白和高密度脂蛋白亞類鑒定在乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌發(fā)生風險預(yù)測中的意義

羅恒 衛(wèi)向紅 吳清明 向世強 張若涵

肝臟是脂類合成和代謝的主要器官，肝臟受損與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)，近年來發(fā)現(xiàn)由于脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率逐漸上升[1]。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度低脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平異常與HCC的發(fā)展密切相關(guān)[2]。LDL和HDL可根據(jù)不同分離技術(shù)分為多種亞型，比如：凝膠電泳方法可將LDL分為7種亞型LDL1～7，HDL可分為HDL2a、HDL2b、HDL3a、 HDL3b 和 HDL3c等多個亞型[3-4]。這些亞型與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展獨立相關(guān)，但對LDL、HDL亞型在HCC發(fā)生中的作用研究相對較少。我們研究了LDL、HDL亞型在肝癌發(fā)生中的作用和其對乙型肝炎(hepatitis B virus，HBV)感染相關(guān)性HCC患者預(yù)后評估的價值，為進一步探索HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)病機制和提高肝癌患者的生成預(yù)后提供新的思路。

對象和方法

一、對象

在2017年1～12月期間，前瞻性納入90例在空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院接受診斷和治療的肝病患者，病因?qū)W有明確的HBV感染史，且經(jīng)乙肝五項定量或HBV-DNA檢測確定為乙肝病毒攜帶者。根據(jù)臨床診斷標準(4項中至少符合2項)或肝穿刺組織學檢查診斷，確診為HCC的患者納入肝癌組(n=30)，男性患者21例，女性患者9例，平均年齡(54.07±10.13)歲，出現(xiàn)肝硬化但證實尚未發(fā)生癌變的患者納入肝硬化組(n=30)，男性患者19例，女性患者11例，平均年齡(54.23±8.11)歲。其余患者則納入慢性肝炎組(n=30)，男性患者22例，女性患者8例，平均年齡(55.83±9.21)歲。納入標準：就診前無抗腫瘤治療史；具備完善的臨床信息，包括B型超聲、相關(guān)血清學檢查和肝活檢等。合并酒精性/非酒精性肝炎、丙型病毒、戊型病毒感染的患者被排除在外，此外肝衰竭和腎臟功能嚴重障礙的患者也應(yīng)該被剔除研究。本研究的所有患者均給出了書面的知情同意書，同時本研究得到了我院倫理委員會批準。

二、方法

1.檢測指標：過夜禁食12 h以上后，平行收集2份靜脈血樣本3 ml和4 ml，離心獲得血清后，一管送往檢驗科，在2 h內(nèi)通過標準酶比色法檢測總膽固醇、HDL-C，利用Friedewald公式計算LDL-C水平。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解凍。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解凍。使用Lipoprint系統(tǒng)(美國Quantimetrix公司)和聚丙烯酰胺凝膠電泳對LDL亞類進行鑒定，電泳時間60 min，電流3 mA，利用數(shù)字掃描儀和全自動計算機對電泳結(jié)果進行量化。LDL亞類分布為七個帶(LDL1～7)，與梯度凝膠電泳獲得的數(shù)據(jù)一致。大LDL：LDL1～2，小而密LDL(small dense low density lipoprotein，sdLDL)：LDL3～7。利用二維凝膠電泳和免疫印跡法對HDL亞類進行鑒定，使用標準曲線(包括牛血清白蛋白、鐵蛋白和甲狀腺球蛋白)對HDL濃度值進行校準，將每個HDL亞類的相對百分比濃度乘以樣品中的apoA-I濃度得出相對濃度apoA-I的每個HDL亞類的含量(mg/L)。

三、統(tǒng)計方法

使用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。將計量資料進行K-S正態(tài)性檢驗和方差齊性分析，所有計量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用事后LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例(%)表示，進行χ2檢驗。采用Logistic回歸模型分析影響肝病患者發(fā)生肝癌的危險因素。受試者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲線分析LDL、HDL亞類對肝癌發(fā)生的預(yù)測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者臨床資料比較見表1。 與慢性肝炎組比較，肝硬化組AST、LDL-C水平顯著降低，肝癌組總膽固醇顯著增加， AST、HDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與肝硬化組比較，肝癌組總膽固醇顯著增加， AST、HDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 3組臨床資料比較

2.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者LDL和HDL亞型比較見表2。 與慢性肝炎組比較，肝硬化和肝癌患者sdLDL水平顯著上升，HDL2和HDL3水平顯著降低，。與肝硬化組比較，肝癌患者sdLDL水平顯著上升，HDL2和HDL3水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 3組LDL、HDL亞型比較(mg/L)

3.Logistic回歸模型分析影響HBV相關(guān)性肝癌發(fā)病風險的臨床因素 經(jīng)Logistic模型分析，單因素分析結(jié)果顯示總膽固醇、HDL、sdLDL、HDL3都是影響慢性肝病患者發(fā)生肝癌的危險因素，將上述變量納入多因素模型，結(jié)果顯示sdLDL水平上升和HDL3水平下降是影響慢性肝病患者發(fā)生肝癌的獨立危險因素。見表3。

表3 logistic模型分析影響慢性肝病患者發(fā)生肝癌的臨床因素

4.ROC曲線 血清sdLDL、HDL3預(yù)測肝癌的AUC為0.899(0.835～0.964)、0.816(0.731～0.902)。截斷值為28.295mg/L、20.06mg/L，特異度為0.883、0.967，靈敏度為0.867、0.600。見圖1。

圖1 ROC曲線分析sdLDL、HDL3對肝癌的預(yù)測價值(A)sdLDL；(B)HDL3

討論

HCC是來自肝臟上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別排到了惡性腫瘤的第6、4位，影響肝癌發(fā)生的因素很多，包括：病毒感染、酗酒、黃曲霉素暴露等[5]。近年來發(fā)現(xiàn)在慢性肝臟疾病中存在脂蛋白異常，肝臟脂質(zhì)失調(diào)是肝臟受損的基本特征[6]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在肝受損患者中存在脂蛋白代謝異常，特別是LDL亞組sdLDL和HDL亞組HDL3，較高的sdLDL和較低的HDL3水平提示慢性HBV相關(guān)性肝病患者更容易發(fā)生肝癌。

肝臟是重要的脂質(zhì)代謝器官，是產(chǎn)生內(nèi)源性脂質(zhì)和脂蛋白聚集的中心。脂質(zhì)代謝異常與腫瘤形成、進展以及治療后的預(yù)后顯著相關(guān)。肝臟可以合成約75%的內(nèi)源性膽固醇，LDL-C主要通過肝細胞合成，LDL-C和LDL水平反映了肝臟合成能力。當肝臟受損后，LDL-C和LDL水平開始下降[7]。LDL主要可劃分為大LDL和sdLDL，近年來發(fā)現(xiàn)不同亞組份的LDL對疾病的發(fā)生具有不同的作用。比如與甘油三酯、LDL等比較，在心血管疾病中sdLDL對預(yù)測冠心病等的發(fā)生更敏感，這可能與sdLDL導(dǎo)致更強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使內(nèi)皮細胞受損壞死有關(guān)[8]。sdLDL的增加與肥胖、胰島素抵抗相關(guān)，據(jù)報道，丙型病毒感染的患者在基于干擾素的療法或任何DAA療法清除丙肝病毒治療后，可能會出現(xiàn)動脈粥樣硬化病變，在開始治療后的一年這部分肝炎患者血清sdLDL、LDL水平都顯著升高。同時研究還表明了sdLDL的增加與頸動脈中膜厚度密切相關(guān)[9]。這提示我們對于肝炎患者在治療后的一段時間內(nèi)對sdLDL水平的監(jiān)測是具有意義的。同時有研究發(fā)現(xiàn)，在日本男性脂肪肝的受試者中，其sdLDL顯著增加[10]。在另一項非酒精性脂肪肝炎的研究中發(fā)現(xiàn)，sd-LDL與超聲心動圖顯示的控制衰減參數(shù)值呈正相關(guān)，同時還與肝纖維化程度呈現(xiàn)正相關(guān)[11]。在肝外膽管癌中，Guo等[12]發(fā)現(xiàn)sd-LDL水平升高，而在膽汁淤積緩解后，sd-LDL降低。我們據(jù)此猜測，在慢性肝疾病的進展過程中，持續(xù)的sdLDL水平升高可能是加劇疾病的原因。我們發(fā)現(xiàn)，在HCC患者中，LDL-C的水平增加，同時sdLDL水平也顯著上升。而在風險模型分析后也證實了血清sdLDL水平是影響HBV相關(guān)性慢性肝病患者發(fā)生癌變的獨立危險因素。此外，LDL亞型還與肝臟疾病治療后的預(yù)后相關(guān)。Siddiqui等[13]發(fā)現(xiàn)sd-LDL對肝移植后的心血管事件發(fā)生獨立相關(guān)，sdLDL可以獨立的預(yù)測肝移植后的心血管事件發(fā)生風險。

HDL-C是膽固醇在肝臟代謝的一部分，最近的研究顯示，在肝臟腫瘤組織中HDL-C水平顯著降低。在HCC發(fā)生時，膽固醇的代謝和合成途徑都受到損傷，因此在血漿中膽固醇水平降低。而隨著肝臟受損的進展，肝臟對HDL-C的消耗逐漸增加[2]。HDL2和LDL3是HDL的亞組成分，有研究顯示在肝硬化患者中，隨著疾病的進展，穩(wěn)定型肝硬化、急性代償期、肝衰竭患者中的HDL-C、HDL2-C、HDL3-C的水平依次降低，HDL-C、HDL2-C、HDL3-C可以作為肝硬化疾病進展和存活的可靠性預(yù)測因子[14]。HDL2(HDL2b、HDL2c)屬于大顆粒HDL，HDL3(HDL3a、HDL3b、HDL3c)屬于小顆粒HDL，有研究發(fā)現(xiàn)在正常血脂血清中使用肝癌細胞進行孵育，血清中的HDL2b降低，而HDL3a釋放增加[15]。提示我們肝癌患者中HDL亞組水平異常。Hayashi等[16]研究者證明在經(jīng)過藥物治療12個月后，2型糖尿病患者血清HDL2、1bLDL-C的水平顯著上升，同時sdLDL-C水平降低。這也提示我們LDL、HDL亞型在內(nèi)環(huán)境脂質(zhì)異常中具有重要作用，具有反映內(nèi)環(huán)境脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的潛能。我們的研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者中血清HDL3的水平降低。

總之，我們通過分析不同肝病患者血清LDL、HDL亞型，發(fā)現(xiàn)血清sdLDL和HDL3水平與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生風險有關(guān)，這值得我們在未來進行更深入的探討。在HBV感染的慢性肝疾病患者中，對血清LDL、HDL亞型進行監(jiān)測和鑒定，有助于預(yù)測疾病的進展風險，并及時進行干預(yù)。