胃癌組織中維甲酸相關孤兒受體α、微管相關蛋白輕鏈3的表達與病人遠期預后的關系

薛志有 倪志海 張毅

我國胃癌早期診斷率較低，病死率較高，主要是術后腫瘤復發(fā)及轉移所致。了解胃癌病人病情發(fā)生、發(fā)展過程并進行有效評估，對提高病人生命質(zhì)量具有重要意義[1-2]。維甲酸相關孤兒受體α(retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα)在人體脂肪、骨骼肌和大腦組織中廣泛表達，可與孤兒核受體(REV-ERBα)作用發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝、炎癥反應、癌癥等相關活動[3-4]。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPLC3)是自噬體特異性標志蛋白，在腫瘤細胞自噬過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究以82例胃癌病人為研究對象，檢測其胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，探討其表達與胃癌病人遠期預后的關系。

對象與方法

一、對象

我院2018年1月～2018年6月收治的胃癌病人82例，男性54例，女性28例；年齡31～82歲，平均年齡(60.32±3.14)歲。根據(jù)病人3年生存情況將病人分為死亡組(32例)和存活組(50例)。納入標準：(1)診斷符合美國腫瘤聯(lián)合會及抗癌聯(lián)盟胃癌診斷及分期系統(tǒng)標準[7-8]，年齡>18歲；(2)臨床資料完整；(3)術前未進行放化療或靶向治療；(4)病人或家屬知情且簽署知情同意書。排除標準：合其他惡性腫瘤者；合并嚴重心、肝、腎功能障礙或疾??；合并全身性感染；認知障礙或精神疾??；其他原因?qū)е碌乃劳?。本研究獲得我院倫理委員會批準。

二、方法

1.取病人癌組織和癌旁組織標本制作成4 μm厚石蠟切片，采用免疫組織化學染色法檢測組織中RORα表達MAPLC3。室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘，加入一抗室溫孵育2小時，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，自來水清洗3分鐘吹干。每張切片隨機取5個視野在200倍顯微鏡下進行閱片，棕黃色顆粒為陽性。組織中RORα免疫組織化學染色結果強度評分進行最終結果判定。細胞內(nèi)染色強度評分標準為，無染色為0分，染色強度≤25%為1分，染色強度5%～25%為2分，染色強度≥50為3分，0～2分為陰性，3分為陽性。組織中MAPLC3免疫組織化學染色結果以每張切片著色程度與著色細胞百分率乘積作為最終評分結果。細胞內(nèi)染色強度評分標準為，無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；無陽性細胞為0分，陽性細胞所占比例≤10%為1分，陽性細胞所占比例10%～50%為2分，陽性細胞所占比例50%～75%為3分，陽性細胞所占比例75%以上為4分。以每張切片著色程度與著色細胞百分率乘積作為最終評分結果，癌組織評分≤3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

2.隨訪：記錄3年病人生存情況，每周進行1次電話聯(lián)系，每月進行1次門診復診邀約。截止2021年6月31日。

3.觀察指標：(1)不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較;(2)胃癌組織中RORα、MAPLC3陽性表達在各項臨床病理因素中分布;(3)比較兩組不同預后病人性別、年齡、腫瘤大小、癌細胞類型、病理分級、T分期、分化程度、淋巴結轉移等因素情況及胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，確定與胃癌病人遠期預后相關因素;(4)對T分期、分化程度、淋巴結轉移、RORα、MAPLC3表達等胃癌預后相關單因素進行COX多因素回歸分析，篩選出獨立危險因素。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用例(%)表示，采用χ2檢驗，多因素分析采用COX回歸分析，預后關系分析采用ROC曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較：癌組織中RORα陽性表達率為42.68%，MAPLC3陽性表達率為43.90%，癌旁組織分別為84.15%、91.46%，兩種組織比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較(例，%)

2.胃癌組織RORα、MAPLC3表達與臨床病理因素的關系：胃癌組織中RORα、MAPLC3表達與病人性別、年齡、腫瘤大小、癌細胞類型、病理分級差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；RORα表達與T分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，MAPLC3表達與T分期、分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表2。3年隨訪期內(nèi)，82例病人中50例存活，32例死亡。

表2 胃癌組織RORα、MAPLC3表達與臨床病理因素的關系(例，%)

3.胃癌病人遠期預后單因素分析見表3。結果表明，T分期、分化程度、淋巴結轉移、RORα表達、MAPLC3表達與胃癌病人遠期預后相關(P<0.05)。

表3 胃癌病人遠期預后單因素分析(例，%)

4.胃癌病人遠期預后多因素分析見表4。結果顯示，T分期(OR=1.779，95%CI：1.109～5.656)、分化程度(OR=1.621，95%CI：1.029～2.554)、淋巴結轉移(OR=1.876，1.020～3.451)、RORα(OR=2.815，95%CI：1.401～5.656)、MAPLC3(OR=3.080，95%CI：1.305～7.268)是胃癌病人遠期預后的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 胃癌病人遠期預后多因素COX回歸分析

5.胃癌組織中RORα、MAPLC3與胃癌遠期預后的ROC曲線：胃癌組織中RORα陽性表達在評估胃癌病人預后生存的曲線下面積為0.67(95%CI：1.024～3.216)，敏感性為72.34%，特異度為64.58%；胃癌組織中MAPLC3陽性表達在評估胃癌病人預后生存的曲線下面積為0.65(95%CI：1.023～2.547)，敏感性為74.52%，特異度為65.13%。見圖1。

圖1 胃癌組織中RORα、MAPLC3與胃癌遠期預后的ROC曲線

討論

胃癌發(fā)病率和死亡率呈增加趨勢，外科手術是根治性治療的主要方式，但術后復發(fā)和轉移是影響病人預后的重要原因[9-10]。胃組織惡性病變過程多細胞因子異常表達和信號轉導參與其中，靶基因自噬在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。MAPLC3是自噬相關基因同源物，RORα可調(diào)節(jié)基因相關活動，參與疾病發(fā)生發(fā)展過程[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人組織中RORα、MAPLC3表達下降，RORα、MAPLC3低表達是胃癌病人遠期預后的獨立影響因素。

本研究結果顯示，胃癌組織中RORα、MAPLC3表達低于癌旁組織，說明RORα、MAPLC3在胃癌組織中表達下降，RORα、MAPLC3異常表達可能參與惡性腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。有研究表明，RORα可通過與REV-ERBα結合影響白細胞介素-6、炎癥因子、蛋白酶抑制劑、糖脂代謝指標等蛋白因子表達，促進免疫疾病、心血管疾病的發(fā)病過程，RORα表達下降，導致凋亡蛋白激活，進而誘導凋亡因子表達，導致細胞凋亡。MAPLC3是自噬同源物，MAPLC3表達下降，自噬體減少，細胞自噬水平降低，自噬抑制腫瘤生長能力降低，腫瘤細胞活化，進而參與胃癌腫瘤生長分化過程[13-14]。癌組織中RORα、MAPLC3表達缺失與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關。RORα陽性表達與T分期、淋巴結轉移有關，MAPLC3陽性表達與T分期、分化程度、淋巴結轉移有關。單因素和多因素分析結果顯示，T分期、分化程度、淋巴結轉移、RORα、MAPLC3表達是胃癌病人遠期的影響因素，說明隨著T分期、分化程度的升高和淋巴結轉移的發(fā)生，及RORα、MAPLC3表達較低病人，胃癌惡性程度升高，預后較差。RORα可通過特異性基因調(diào)節(jié)參與基因表達調(diào)控，通過與輔激活因子或輔抑制因子結發(fā)揮基因轉錄作用，進而改變靶基因構象。惡性腫瘤與癌基因和抑癌基因表達相關，細胞惡性增殖是惡性腫瘤發(fā)病的重要前提，RORα可通過與REV-ERBα結合調(diào)控BMAL1和COLCK基因表達，進而激活p73凋亡蛋白，導致Caspase-3、Bax、Bcl-2等相關凋亡因子表達，細胞凋亡加劇[15-16]。有研究表明，RORs可通過調(diào)節(jié)Th17細胞表達參與多種免疫性疾病發(fā)生，對肝癌發(fā)病具有重要意義，RORα可誘導基因表達而影響癌細胞的侵襲能力[17-18]。因此，RORα低表達影響胃癌的發(fā)展及預后。MAPLC3位于前自噬泡和自噬泡表面，可反映自噬體數(shù)量，是自噬體特異性標志蛋白，參與自噬調(diào)控，MAPLC3活化時可促進自噬體形成。MAPLC3表達缺失，自噬體減少會導致氧化應激，增加瘤性突變，導致腫瘤細胞增殖、分化及侵襲轉移[19-20]。因此，MAPLC3表達缺失與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預后相關。

另外，ROC曲線結果顯示，胃癌組織RORα表達評估胃癌病人預后生存的曲線下面積為0.67，敏感性為72.34%，特異度為64.58%；胃癌組織MAPLC3表達在評估胃癌病人預后生存的曲線下面積為的曲線下面積為0.65，敏感性為74.52%，特異度為65.13%，說明胃癌組織中RORα、MAPLC3表達對胃癌病人遠期預后具有較好評估作用。因為RORα可與靶基因上相關蛋白結合，抑制Wnt信號通路，參與細胞增殖和腫瘤進展調(diào)控。RORα表達下降，細胞增殖增加，促進胃癌發(fā)生發(fā)展[21-22]。自噬可對受損細胞進行清除，保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。MAPLC3在前自噬泡以及自噬泡膜表面顯著表達，因此，MAPLC3表達可反映自噬狀態(tài)，進而為腫瘤增殖、生長評估提供參考。因此，RORα、MAPLC3低表達病人癌細胞侵襲力高，惡性程度高，且易發(fā)生轉移，病人預后較差需及時調(diào)整治療方案[23-24]。由于本次樣本量較少，且基因表達的多樣性生物學作用較復雜，還需擴大樣本，充分了解其分子機制。

綜上所述，胃癌組織中RORα、MAPLC3低表達是胃癌病人遠期預后的獨立危險因素，RORα、MAPLC3表達缺失是胃癌病人復發(fā)轉移的影響因素，檢測胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，可為胃癌病人病情程度及預后評估提供參考。