胃癌組織中維甲酸相關(guān)孤兒受體α、微管相關(guān)蛋白輕鏈3的表達與病人遠期預(yù)后的關(guān)系

薛志有 倪志海 張毅

我國胃癌早期診斷率較低，病死率較高，主要是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移所致。了解胃癌病人病情發(fā)生、發(fā)展過程并進行有效評估，對提高病人生命質(zhì)量具有重要意義[1-2]。維甲酸相關(guān)孤兒受體α(retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα)在人體脂肪、骨骼肌和大腦組織中廣泛表達，可與孤兒核受體(REV-ERBα)作用發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝、炎癥反應(yīng)、癌癥等相關(guān)活動[3-4]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPLC3)是自噬體特異性標(biāo)志蛋白，在腫瘤細胞自噬過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究以82例胃癌病人為研究對象，檢測其胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，探討其表達與胃癌病人遠期預(yù)后的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

我院2018年1月～2018年6月收治的胃癌病人82例，男性54例，女性28例；年齡31～82歲，平均年齡(60.32±3.14)歲。根據(jù)病人3年生存情況將病人分為死亡組(32例)和存活組(50例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合美國腫瘤聯(lián)合會及抗癌聯(lián)盟胃癌診斷及分期系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，年齡>18歲；(2)臨床資料完整；(3)術(shù)前未進行放化療或靶向治療；(4)病人或家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合其他惡性腫瘤者；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙或疾病；合并全身性感染；認(rèn)知障礙或精神疾??；其他原因?qū)е碌乃劳?。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

1.取病人癌組織和癌旁組織標(biāo)本制作成4 μm厚石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中RORα表達MAPLC3。室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘，加入一抗室溫孵育2小時，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水清洗3分鐘吹干。每張切片隨機取5個視野在200倍顯微鏡下進行閱片，棕黃色顆粒為陽性。組織中RORα免疫組織化學(xué)染色結(jié)果強度評分進行最終結(jié)果判定。細胞內(nèi)染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)為，無染色為0分，染色強度≤25%為1分，染色強度5%～25%為2分，染色強度≥50為3分，0～2分為陰性，3分為陽性。組織中MAPLC3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以每張切片著色程度與著色細胞百分率乘積作為最終評分結(jié)果。細胞內(nèi)染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)為，無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；無陽性細胞為0分，陽性細胞所占比例≤10%為1分，陽性細胞所占比例10%～50%為2分，陽性細胞所占比例50%～75%為3分，陽性細胞所占比例75%以上為4分。以每張切片著色程度與著色細胞百分率乘積作為最終評分結(jié)果，癌組織評分≤3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

2.隨訪：記錄3年病人生存情況，每周進行1次電話聯(lián)系，每月進行1次門診復(fù)診邀約。截止2021年6月31日。

3.觀察指標(biāo)：(1)不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較;(2)胃癌組織中RORα、MAPLC3陽性表達在各項臨床病理因素中分布;(3)比較兩組不同預(yù)后病人性別、年齡、腫瘤大小、癌細胞類型、病理分級、T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素情況及胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，確定與胃癌病人遠期預(yù)后相關(guān)因素;(4)對T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RORα、MAPLC3表達等胃癌預(yù)后相關(guān)單因素進行COX多因素回歸分析，篩選出獨立危險因素。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用例(%)表示，采用χ2檢驗，多因素分析采用COX回歸分析，預(yù)后關(guān)系分析采用ROC曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較：癌組織中RORα陽性表達率為42.68%，MAPLC3陽性表達率為43.90%，癌旁組織分別為84.15%、91.46%，兩種組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中RORα、MAPLC3表達水平比較(例，%)

2.胃癌組織RORα、MAPLC3表達與臨床病理因素的關(guān)系：胃癌組織中RORα、MAPLC3表達與病人性別、年齡、腫瘤大小、癌細胞類型、病理分級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；RORα表達與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，MAPLC3表達與T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。3年隨訪期內(nèi)，82例病人中50例存活，32例死亡。

表2 胃癌組織RORα、MAPLC3表達與臨床病理因素的關(guān)系(例，%)

3.胃癌病人遠期預(yù)后單因素分析見表3。結(jié)果表明，T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RORα表達、MAPLC3表達與胃癌病人遠期預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。

表3 胃癌病人遠期預(yù)后單因素分析(例，%)

4.胃癌病人遠期預(yù)后多因素分析見表4。結(jié)果顯示，T分期(OR=1.779，95%CI：1.109～5.656)、分化程度(OR=1.621，95%CI：1.029～2.554)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=1.876，1.020～3.451)、RORα(OR=2.815，95%CI：1.401～5.656)、MAPLC3(OR=3.080，95%CI：1.305～7.268)是胃癌病人遠期預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 胃癌病人遠期預(yù)后多因素COX回歸分析

5.胃癌組織中RORα、MAPLC3與胃癌遠期預(yù)后的ROC曲線：胃癌組織中RORα陽性表達在評估胃癌病人預(yù)后生存的曲線下面積為0.67(95%CI：1.024～3.216)，敏感性為72.34%，特異度為64.58%；胃癌組織中MAPLC3陽性表達在評估胃癌病人預(yù)后生存的曲線下面積為0.65(95%CI：1.023～2.547)，敏感性為74.52%，特異度為65.13%。見圖1。

圖1 胃癌組織中RORα、MAPLC3與胃癌遠期預(yù)后的ROC曲線

討論

胃癌發(fā)病率和死亡率呈增加趨勢，外科手術(shù)是根治性治療的主要方式，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響病人預(yù)后的重要原因[9-10]。胃組織惡性病變過程多細胞因子異常表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與其中，靶基因自噬在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。MAPLC3是自噬相關(guān)基因同源物，RORα可調(diào)節(jié)基因相關(guān)活動，參與疾病發(fā)生發(fā)展過程[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人組織中RORα、MAPLC3表達下降，RORα、MAPLC3低表達是胃癌病人遠期預(yù)后的獨立影響因素。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中RORα、MAPLC3表達低于癌旁組織，說明RORα、MAPLC3在胃癌組織中表達下降，RORα、MAPLC3異常表達可能參與惡性腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。有研究表明，RORα可通過與REV-ERBα結(jié)合影響白細胞介素-6、炎癥因子、蛋白酶抑制劑、糖脂代謝指標(biāo)等蛋白因子表達，促進免疫疾病、心血管疾病的發(fā)病過程，RORα表達下降，導(dǎo)致凋亡蛋白激活，進而誘導(dǎo)凋亡因子表達，導(dǎo)致細胞凋亡。MAPLC3是自噬同源物，MAPLC3表達下降，自噬體減少，細胞自噬水平降低，自噬抑制腫瘤生長能力降低，腫瘤細胞活化，進而參與胃癌腫瘤生長分化過程[13-14]。癌組織中RORα、MAPLC3表達缺失與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RORα陽性表達與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MAPLC3陽性表達與T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。單因素和多因素分析結(jié)果顯示，T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RORα、MAPLC3表達是胃癌病人遠期的影響因素，說明隨著T分期、分化程度的升高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，及RORα、MAPLC3表達較低病人，胃癌惡性程度升高，預(yù)后較差。RORα可通過特異性基因調(diào)節(jié)參與基因表達調(diào)控，通過與輔激活因子或輔抑制因子結(jié)發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄作用，進而改變靶基因構(gòu)象。惡性腫瘤與癌基因和抑癌基因表達相關(guān)，細胞惡性增殖是惡性腫瘤發(fā)病的重要前提，RORα可通過與REV-ERBα結(jié)合調(diào)控BMAL1和COLCK基因表達，進而激活p73凋亡蛋白，導(dǎo)致Caspase-3、Bax、Bcl-2等相關(guān)凋亡因子表達，細胞凋亡加劇[15-16]。有研究表明，RORs可通過調(diào)節(jié)Th17細胞表達參與多種免疫性疾病發(fā)生，對肝癌發(fā)病具有重要意義，RORα可誘導(dǎo)基因表達而影響癌細胞的侵襲能力[17-18]。因此，RORα低表達影響胃癌的發(fā)展及預(yù)后。MAPLC3位于前自噬泡和自噬泡表面，可反映自噬體數(shù)量，是自噬體特異性標(biāo)志蛋白，參與自噬調(diào)控，MAPLC3活化時可促進自噬體形成。MAPLC3表達缺失，自噬體減少會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，增加瘤性突變，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖、分化及侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。因此，MAPLC3表達缺失與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。

另外，ROC曲線結(jié)果顯示，胃癌組織RORα表達評估胃癌病人預(yù)后生存的曲線下面積為0.67，敏感性為72.34%，特異度為64.58%；胃癌組織MAPLC3表達在評估胃癌病人預(yù)后生存的曲線下面積為的曲線下面積為0.65，敏感性為74.52%，特異度為65.13%，說明胃癌組織中RORα、MAPLC3表達對胃癌病人遠期預(yù)后具有較好評估作用。因為RORα可與靶基因上相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制Wnt信號通路，參與細胞增殖和腫瘤進展調(diào)控。RORα表達下降，細胞增殖增加，促進胃癌發(fā)生發(fā)展[21-22]。自噬可對受損細胞進行清除，保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。MAPLC3在前自噬泡以及自噬泡膜表面顯著表達，因此，MAPLC3表達可反映自噬狀態(tài)，進而為腫瘤增殖、生長評估提供參考。因此，RORα、MAPLC3低表達病人癌細胞侵襲力高，惡性程度高，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病人預(yù)后較差需及時調(diào)整治療方案[23-24]。由于本次樣本量較少，且基因表達的多樣性生物學(xué)作用較復(fù)雜，還需擴大樣本，充分了解其分子機制。

綜上所述，胃癌組織中RORα、MAPLC3低表達是胃癌病人遠期預(yù)后的獨立危險因素，RORα、MAPLC3表達缺失是胃癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素，檢測胃癌組織中RORα、MAPLC3表達，可為胃癌病人病情程度及預(yù)后評估提供參考。