干熱處理對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的影響

陳怡靜，李萍，康雨薇，高璐，王琨，崔桂友*，許慧卿*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.江蘇旅游職業(yè)學(xué)院烹飪科技學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225500；3.江蘇康能生物工程股份有限公司，江蘇 儀征 211413）

杏鮑菇是一種藥食兩用的食用菌品種，具有獨(dú)特的莖、宜人的香氣和良好的烹飪品質(zhì)。此外，杏鮑菇還含有大量的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維等，均具有潛在的生物活性功能。

熱處理在食品加工行業(yè)中廣泛用于促進(jìn)食品的功能性質(zhì)。干熱處理是熱處理的一種，是對(duì)食品進(jìn)行物理改性的一種方法，它以空氣為介質(zhì)，通過提高介質(zhì)的溫度使物質(zhì)內(nèi)部溫度升高，從而使食物表面和內(nèi)部達(dá)到相同溫度。在干熱加熱過程中，蛋白質(zhì)在高溫、低水分條件下，通過影響蛋白質(zhì)分子的化學(xué)鍵，特別是疏水鍵，引起蛋白質(zhì)分子的重新排列，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的變化，如蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)聚合物的形成、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生等。

目前對(duì)蛋白質(zhì)高溫變性的研究大多是在濕熱條件下進(jìn)行的。張雪飛通過研究濕熱誘導(dǎo)對(duì)聚乳清蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)巰基隨著溫度的變化而減少。劉芳等在研究堿與熱處理對(duì)大米蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溶解性無明顯變化，但乳化性和穩(wěn)定性在90℃時(shí)均達(dá)到最大。近年來對(duì)杏鮑菇的研究多集中在杏鮑菇多糖的提取或以杏鮑菇為原料進(jìn)行產(chǎn)品創(chuàng)新，對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)的研究相對(duì)較少，特別是以干熱作為加熱處理方式的相關(guān)研究更為少見。本文旨在研究不同干熱溫度對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響，從杏鮑菇蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能特性等方面研究干熱處理對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)的作用機(jī)理，以拓寬干熱處理杏鮑菇蛋白質(zhì)在多種食品中的應(yīng)用，為其開發(fā)新型工業(yè)化成品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮杏鮑菇：市售；磷酸鹽緩沖液：上海博微生物科技有限公司；Tris-甘氨酸（Gly）緩沖液：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；尿素：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇：慧興生化試劑有限公司；雙縮脲試劑：廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；Ellman’s試劑：安徽酷爾生物工程有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；J-810圓二色光譜儀：日本JASCO公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：上海棱光有限公司；FSH2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)：上海索廷智能設(shè)備股份有限公司；BDW1-FW-200高速粉碎機(jī)：北京中西華大科技有限公司；SHZ-C水浴振蕩器：北京海天友誠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮杏鮑菇切片，45℃烘干12h。杏鮑菇經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩，置于密封容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 杏鮑菇蛋白的分離

將粒度均勻的杏鮑菇粉與去離子水按1∶15（g/mL）混合，參照柳芬芳等的方法提取杏鮑菇蛋白質(zhì)。將溶液用NaOH調(diào)pH值至12，連續(xù)振蕩2.5 h后，4 000×g離心20 min。用HCl將pH值調(diào)至3.6，于4℃冰箱中靜置1h，直至出現(xiàn)沉淀。將溶液于中4 000×g離心10 min，取沉淀調(diào)節(jié)pH值至中性。經(jīng)冷凍干燥后4℃冷藏備用。

1.3.3 杏鮑菇分離蛋白的干熱處理

將 1.3.2得到的蛋白粉在 65、80、95、110、125 ℃下干熱處理30 min，冷卻至25℃，放入真空袋中保存?zhèn)溆?，并以未干熱處理的杏鮑菇蛋白粉（即生樣）為對(duì)照。

1.3.4 杏鮑菇蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 巰基的測(cè)定

參考Ellman和Benesch的方法并稍作修改，測(cè)定不同杏鮑菇蛋白質(zhì)處理組的巰基（sulfhydryl group，SH）。稱取杏鮑菇分離蛋白用8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素緩沖液配制成0.6%的蛋白溶液。搖勻后取溶液測(cè)定游離巰基和總巰基的含量。同時(shí)，將牛血清蛋白配制成 0、2、4、6、8、10 mg/mL 蛋白溶液，與雙縮脲試劑混合均勻后靜置反應(yīng)10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量540 nm下的OD值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.042 5x+0.001 5。以同樣方法測(cè)量其樣品蛋白在540 nm下的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，記為C（mg/mL）。

游離巰基含量的測(cè)定：取蛋白溶液加入4%、4 mg/mL DTNB溶液，混合振蕩5 min，在412 nm波長下測(cè)吸光值記為A。

總巰基含量的測(cè)定：取蛋白溶液，加入0.2%β-巰基乙醇溶液，振蕩混勻2 h，以體積比1∶2加入12%TCA溶液，靜置1 h后，10 000×g離心10 min，棄上清液，取一定體積8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素緩沖液溶解沉淀，再加入Ellman’s試劑，然后用紫外分光光度計(jì)在波長412 nm下測(cè)定吸光值。

式中：73.53為埃爾曼試劑的摩爾消光系數(shù)。

1.3.4.2 溶解度的測(cè)定

參考Lee等的方法測(cè)定杏鮑菇分離蛋白的溶解度。配制0.4%的蛋白溶液，恒溫振蕩10 min，離心15 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定離心前后樣品中的蛋白質(zhì)含量。杏鮑菇分離蛋白的溶解度計(jì)算公式如下。

1.3.4.3 發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Oboroceanu等的方法測(cè)定杏鮑菇蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力及其穩(wěn)定性。取50 mL杏鮑菇蛋白溶液（1%）用勻質(zhì)機(jī)在10 000 r/min、25℃下均質(zhì)2 min。通過比較0 min時(shí)的泡沫體積與樣品的初始液體體積來測(cè)定發(fā)泡能力。發(fā)泡穩(wěn)定性是比較10 min和20 min的泡沫體積與樣品的初始泡沫體積。計(jì)算公式如下。

式中：V為 0 min 時(shí)的泡沫體積，mL；V為 10 min和20 min時(shí)的泡沫體積，mL。

1.3.4.4 微觀結(jié)構(gòu)

形態(tài)特征：采用掃描電鏡分別對(duì)各組杏鮑菇分離蛋白的形態(tài)特征進(jìn)行觀察。取樣品粘貼到樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金鍍膜處理，放入掃描電鏡抽真空，在10 kV的電壓下，調(diào)整束斑尺寸，聚集清晰后，拍攝樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖像。

圓二色性光譜：采用圓二色譜法對(duì)杏鮑菇蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。參考Chandrapala等的試驗(yàn)方法，配制濃度為0.5 mg/mL的蛋白溶液，在連續(xù)充氮的條件下測(cè)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

光譜分析條件：遠(yuǎn)紫外區(qū)域?yàn)?63 nm～280 nm，掃描速度為10 nm/min，光譜間隔0.1 nm，每個(gè)樣品進(jìn)行3次掃描，取其平均值。

紫外光譜分析：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）配制濃度為1 mg/mL的杏鮑菇分離蛋白溶液，在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描，掃描波長為190 nm～300 nm。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行鄧肯多重范圍檢驗(yàn)（Duncan's multiple range tes，DMRT）分析，采用Origin 2018 64Bit作圖。不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05）。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基檢測(cè)結(jié)果

不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)巰基含量的影響見表1。

表1 不同干熱處理溫度對(duì)巰基含量的影響Table 1 Effect of different dry heat treatment temperature on the sulfhydryl group content of Pleurotus eryngei protein

由表1可知，生樣的杏鮑菇蛋白總巰基含量為84.54 μmol/g 蛋白，游離巰基含量為 21.49 μmol/g蛋白?？値€基和游離巰基的含量均隨干熱溫度的升高而降低。在125℃時(shí)，均最低，分別為39.05 μmol/g蛋白和18.01μmol/g蛋白。干熱處理組中總巰基含量和游離巰基含量均顯著低于對(duì)照組（p＜0.05）。隨著干熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)展開，暴露出內(nèi)部巰基，加速了巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)變，使所測(cè)得巰基含量逐漸下降。趙謀明等觀察到雞肉蛋白中的巰基含量隨著熱處理溫度的升高而逐漸降低，與本研究結(jié)果相似。

2.2 溶解度測(cè)定結(jié)果

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-水相互作用影響溶解度。杏鮑菇蛋白質(zhì)的溶解度分布如圖1所示。

圖1 不同干熱處理溫度對(duì)溶解度的影響Fig.1 Effect of different dry heat treatment temperatures on solubility

由圖1可知，隨著干熱處理溫度的升高，杏鮑菇蛋白質(zhì)的溶解度也逐漸增加，到110℃時(shí)達(dá)到最大值（0.90±0.03）%，然后在125℃時(shí)迅速下降，顯著低于其他處理（p＜0.05），且明顯看出有少量沉淀生成。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是蛋白質(zhì)經(jīng)過干熱處理后，以聚集體的形式存在，蛋白質(zhì)重新組合，導(dǎo)致溶解度急劇下降。這一現(xiàn)象與黃友如等的研究結(jié)果相似。Sun等在研究熱處理對(duì)玉米醇溶蛋白的影響中也證實(shí)了這一變化趨勢(shì)，說明這種現(xiàn)象的發(fā)生并不偶然。

2.3 發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性的影響見表2。

表2 不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白發(fā)泡性能的影響Table 2 Effect of different dry heat treatment temperatures on foaming properties of Pleurotus eryngii protein

由表2可知，杏鮑菇蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力隨溫度的升高在95℃時(shí)達(dá)到最大值（83.23%），95℃之前隨著溫度的升高而升高，95℃之后逐漸下降。除125℃處理組外，其余干熱處理組的發(fā)泡能力均顯著高于生樣。干熱處理后杏鮑菇蛋白的發(fā)泡穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)與發(fā)泡能力正好相反。發(fā)泡穩(wěn)定性在95℃時(shí)最低（52.86%），然后隨溫度的升高逐漸增加。干熱處理20 min后的發(fā)泡穩(wěn)定性略低于處理10 min的樣品。適當(dāng)熱處理使蛋白質(zhì)分子解聚，分子柔韌性增加，導(dǎo)致吸附在界面上的蛋白質(zhì)數(shù)量增加，氣泡膨脹增大，有利于氣泡的改善。但隨著干熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，其溶解度降低，蛋白質(zhì)不易在空氣和水界面上吸附，其發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性降低。夏珂在研究熱處理對(duì)蕎麥蛋白的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，干熱處理使蛋白質(zhì)的起泡性出現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象，但出現(xiàn)最大值時(shí)的溫度與本試驗(yàn)不一致，產(chǎn)生這種差異可能由于蛋白質(zhì)的來源不同。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

2.4.1 形態(tài)特征

圖2為杏鮑菇蛋白在掃描電鏡（4.05 cm×4.80 cm）下的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)形態(tài)特征的影響Fig.2 Effect of different dry heat treatment temperature on morphological（SEM）characteristics of Pleurotus eryngii protein

由圖2可以看出，未經(jīng)干熱處理的杏鮑菇蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和外觀光滑，沒有裂紋和孔洞。經(jīng)過干熱處理后，蛋白質(zhì)表面出現(xiàn)了裂紋和多孔結(jié)構(gòu)，特別是110℃時(shí)，杏鮑菇蛋白顆粒表面孔洞數(shù)量明顯多于其他處理，細(xì)小的裂紋也較多。本試驗(yàn)的結(jié)果與陳世超觀察到的熱處理后蛋白質(zhì)中的裂紋和孔隙相似。Mir等對(duì)藜麥分離蛋白（quinoa protein isolates，QPIs）進(jìn)行熱處理后也觀察到這種現(xiàn)象。馬丹等也證實(shí)了大豆分離蛋白因熱處理而出現(xiàn)開裂和多孔結(jié)構(gòu)。

2.4.2 圓二色性光譜

在蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵是高度有規(guī)律排列的，根據(jù)其肽鍵排列的不同，二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)或多肽，所產(chǎn)生的圓二色譜的譜帶位置、峰的強(qiáng)弱均不同。因此，根據(jù)所測(cè)得的蛋白質(zhì)或多肽的圓二色性光譜（circular dichroism spectrum，CDS），能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)位置。杏鮑菇蛋白的圓二色譜見圖3。

圖3 不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白圓二色譜的影響Fig.3 Effect of different dry heat treatment temperatures on circular dichroism spectra of Pleurotus eryngei protein

由圖3可知，未經(jīng)干熱處理的杏鮑菇蛋白的CD譜在208 nm處有明顯的負(fù)峰，在195 nm處有正峰，說明存在α-螺旋構(gòu)象的特征。隨著溫度的升高，65℃和80℃時(shí)，208 nm和222 nm處的負(fù)峰增強(qiáng)，意味著α-螺旋的百分比增加。溫度超過80℃以后，隨著溫度的升高，208 nm和222 nm處的負(fù)峰明顯減弱。同時(shí)，80℃時(shí)杏鮑菇蛋白在216 nm時(shí)具有最強(qiáng)的正峰，說明β-折疊所占的比例最低。在220 nm附近處有一正峰，表明該蛋白中含有無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在110℃時(shí)正峰最不明顯，說明此溫度下蛋白質(zhì)的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占的比例最低。加熱后的杏鮑菇蛋白譜線在208 nm處向長波長方向移動(dòng)，即發(fā)生紅移。由于發(fā)色團(tuán)吸收光譜發(fā)生位移主要取決于它的微環(huán)境更加親水或疏水的結(jié)果，因此紅移的發(fā)生說明體系的親水性增加，疏水性下降。此現(xiàn)象與上述測(cè)得的疏水性在110℃時(shí)發(fā)生下降的現(xiàn)象相符，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因或許是蛋白質(zhì)分子發(fā)生無規(guī)則聚集形成較大的分子，而使疏水基團(tuán)聚集在大分子內(nèi)部，隱藏了疏水性位點(diǎn)。而低于100℃時(shí)，隨著溫度的升高，疏水性逐漸升高的現(xiàn)象，或許是由于蛋白質(zhì)分子得以展開，α-螺旋結(jié)構(gòu)所占的比例較高，增大了疏水性位點(diǎn)的暴露。在100℃的范圍內(nèi)本研究現(xiàn)象與Miyazawa對(duì)藜麥分離蛋白進(jìn)行熱處理觀察到的結(jié)果相似，但其對(duì)100℃以上的加熱溫度并未進(jìn)行研究。

2.4.3 紫外光譜分析

采用紫外分光光度法分析熱處理對(duì)杏鮑菇蛋結(jié)構(gòu)的影響。由于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、硫氨酸、半胱氨酸和肽鍵對(duì)紫外線的吸收，使蛋白質(zhì)可以在280nm左右處出現(xiàn)吸收峰。不同處理組杏鮑菇蛋白質(zhì)的紫外光譜見圖4。

圖4 不同干熱處理溫度對(duì)杏鮑菇蛋白紫外光譜圖的影響Fig.4 Effect of different dry heat treatment temperature on UV spectrum pattern of Pleurotus eryngii protein

由圖4可知，在80℃時(shí)吸收峰最大，說明在80℃時(shí)暴露的氨基酸和肽鍵數(shù)量最大，在95℃和125℃時(shí)其紫外吸收強(qiáng)度出現(xiàn)了低于未處理蛋白的吸收強(qiáng)度。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)闊崽幚硎沟鞍踪|(zhì)發(fā)生變性，使其三級(jí)結(jié)構(gòu)得以展開，內(nèi)部基團(tuán)得以暴露，隨著溫度的進(jìn)一步升高，在95℃時(shí)紫外強(qiáng)度發(fā)生下降，這種轉(zhuǎn)變或許是由于展開的蛋白質(zhì)小分子進(jìn)一步發(fā)生聚集，使功能基團(tuán)被包裹在內(nèi)部。何興芬研究熱處理對(duì)藜麥蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，在121℃、30 min時(shí)其紫外吸收強(qiáng)度達(dá)到最低值，與本研究所得結(jié)果相似。

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，不同干熱處理溫度可以影響杏鮑菇蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的改變對(duì)蛋白質(zhì)功能有不同的影響。95℃處理30 min，蛋白質(zhì)的大部分功能特性均能得到改善，但溫度的升高對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到125℃時(shí)，蛋白質(zhì)的功能特性普遍不如未處理的杏鮑菇蛋白質(zhì)。杏鮑菇蛋白質(zhì)干熱處理后結(jié)構(gòu)和功能特性的變化為進(jìn)一步研究干熱處理對(duì)杏鮑菇蛋白質(zhì)加工特性的影響提供了參考。