動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)概述及拓展訓(xùn)練

廣東 朱叮叮

一、技術(shù)概述

細(xì)胞全能性是指細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，仍具有產(chǎn)生完整有機(jī)體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能和特性。高度分化的植物細(xì)胞可以通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)成完整植株，但動(dòng)物體細(xì)胞全能性很難實(shí)現(xiàn)，目前尚無成功將單個(gè)已分化的動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)成新個(gè)體的成功案例[1]。類似于植物組織培養(yǎng)中的脫分化，將動(dòng)物體細(xì)胞培育成完整個(gè)體或其他器官組織，首先要將動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞。

當(dāng)前，異體器官和組織移植存在嚴(yán)重的問題：一是缺乏供體，沒有足夠的移植器官來源；二是存在免疫排斥反應(yīng)，異體移植的器官會(huì)逐漸產(chǎn)生功能衰退。自體體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，再用干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為特定組織器官，可以完美解決上述問題，所以動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞是生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，目前學(xué)界有3種主流方法：核移植法、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化法和化學(xué)誘導(dǎo)法。

1.核移植法

核移植是一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)，在高中生物學(xué)教材選擇性必修3中有詳細(xì)的介紹，研究者將動(dòng)物體細(xì)胞細(xì)胞核移植到一個(gè)去核的卵母細(xì)胞中，再用物理或化學(xué)方法激活重組細(xì)胞，進(jìn)而植入母體子宮培養(yǎng)得到個(gè)體。1956年約翰·格登爵士將非洲爪蟾蝌蚪的上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵細(xì)胞中，并培育得到蝌蚪，第一次成功克隆動(dòng)物；1996年英國科學(xué)家培育克隆羊多莉，第一次成功克隆哺乳動(dòng)物；2017年11月27日，中國科學(xué)家培育克隆猴“中中”和“華華”，第一次成功克隆靈長(zhǎng)類動(dòng)物。該技術(shù)可以采用動(dòng)物的多種體細(xì)胞，并且已經(jīng)在多種哺乳動(dòng)物中成功(牛、羊、鼠和猴等)實(shí)現(xiàn)。

核移植技術(shù)目前應(yīng)用具有局限性的原因包括：(1)需要借助卵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞數(shù)量缺乏；(2)靈長(zhǎng)類動(dòng)物重組細(xì)胞的存活率極低(2007年Byrne等的研究中構(gòu)建的304個(gè)卵母細(xì)胞中只有2個(gè)重組細(xì)胞株系成功存活)；(3)重組細(xì)胞遺傳物質(zhì)與體細(xì)胞并不完全一致，其線粒體基因不同；(4)使用生殖細(xì)胞，面臨倫理困境，無法開展臨床實(shí)驗(yàn)。

2.轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化法

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一類結(jié)合DNA調(diào)控區(qū)域[例如增強(qiáng)子(enhancer)和沉默子(silencer)]的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子通常結(jié)合到目的基因的上游(5′端)，并可以調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄。人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多基因控制著轉(zhuǎn)錄因子的合成，轉(zhuǎn)錄因子有很多家族，每個(gè)家族都有一些共同結(jié)構(gòu)特征，例如螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix)、螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)和鋅指(zinc Finger)等。干細(xì)胞中有一些特殊的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于維持細(xì)胞的全能性有重要作用，研究者將這些特殊的轉(zhuǎn)錄因子基因借助載體轉(zhuǎn)化到動(dòng)物體細(xì)胞中，并使其成功表達(dá)，從而誘導(dǎo)動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞。

起初研究者并不清楚哪些轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)過程中起作用，他們利用化學(xué)物質(zhì)改變細(xì)胞膜通透性，接著將干細(xì)胞的細(xì)胞提取物導(dǎo)入到動(dòng)物體細(xì)胞中，然后再從中篩選出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這種方法成功率低，而且轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞遺傳背景復(fù)雜，不利于后續(xù)研究的展開，所以逐漸被淘汰。2006年，日本科學(xué)家山中伸彌選取了24個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，然后將其分別與病毒載體結(jié)合，一起導(dǎo)入到小鼠成纖維細(xì)胞中，結(jié)果成功誘導(dǎo)出了多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPS細(xì)胞)。山中伸彌和他的學(xué)生高橋和利接著采用減法原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次去掉一種重組病毒載體，保留其他23種重組病毒載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功篩選出了能夠?qū)⑿∈蟪衫w維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞的4個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子：Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4[2]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子基因也可以用來將人類體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞，山中伸彌和克隆動(dòng)物第一人約翰·格登爵士因此一起分享了2012年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。iPS細(xì)胞在臨床再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用前景廣闊，它們分裂能力強(qiáng)，并可分化為體內(nèi)所有其他類型的細(xì)胞，可以應(yīng)用于因損傷或疾病而受損的器官或組織的移植。目前已經(jīng)有一些成功應(yīng)用的案例，例如2014年日本科學(xué)家利用老年性黃斑變性患者本人體細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為iPS細(xì)胞，接著繼續(xù)分化培養(yǎng)為角膜細(xì)胞，并成功進(jìn)行移植，有效改善了患者視力，后續(xù)又成功進(jìn)行了多例類似手術(shù)。

3.化學(xué)誘導(dǎo)法

轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化法操作相對(duì)復(fù)雜，而且可能在體細(xì)胞中摻入病毒或其他載體上的DNA序列，存在安全風(fēng)險(xiǎn)。為克服上述問題，一些研究者在山中伸彌開創(chuàng)性工作基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，他們發(fā)現(xiàn)采用某些化學(xué)物質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)產(chǎn)生影響，從而誘導(dǎo)動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受表觀遺傳影響，如DNA的甲基化水平，組蛋白的甲基化水平和組蛋白的乙?；降?；此外轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)還會(huì)受到細(xì)胞中一些激酶的影響，如Rho激酶、糖原合成酶激酶3(GSK3)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等。

人類細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控是非常復(fù)雜和嚴(yán)格的，將人類體細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞長(zhǎng)期以來一直無法突破，2014年甚至出現(xiàn)了日本科學(xué)家小保方晴子學(xué)術(shù)造假事件。近些年來，隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，該領(lǐng)域成果也逐漸增多，中國科學(xué)家2022年在此領(lǐng)域有兩個(gè)突破性的貢獻(xiàn)：2022年3月21日，中國科學(xué)院和深圳華大生命科學(xué)研究院等多家機(jī)構(gòu)在Nature發(fā)文，實(shí)現(xiàn)了人類體細(xì)胞到全能干細(xì)胞(8細(xì)胞階段)的突破，該研究采用了“雞尾酒”(多種化學(xué)物質(zhì))誘導(dǎo)法，并借助華大自主研制的單細(xì)胞建庫測(cè)序平臺(tái)(DNBelab C4)實(shí)現(xiàn)了對(duì)全能干細(xì)胞的快速篩選[3]。2022年4月13日北大-清華生命聯(lián)合中心鄧宏魁研究團(tuán)隊(duì)在Nature發(fā)文，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了大量化學(xué)小分子的篩選和組合，最終發(fā)現(xiàn)高度分化的人類體細(xì)胞在特定的化學(xué)小分子組合的作用下，可以發(fā)生類似植物脫分化的現(xiàn)象，最終培養(yǎng)得到iPS細(xì)胞[4]。

人類體細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞研究在再生醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，但也面臨著一些倫理風(fēng)險(xiǎn)。例如人的判定問題，培養(yǎng)中的人類胚胎干細(xì)胞是否可以視作人；如果不是，又該將胚胎發(fā)育的哪個(gè)階段開始定義為人。利用胚胎干細(xì)胞生成各種器官組織，是否有謀殺生命或者將人商品化的嫌疑。目前學(xué)界的研究都需要事先安排倫理委員會(huì)進(jìn)行審查，臨床應(yīng)用也需要提前申請(qǐng)并接受審查。技術(shù)在不斷進(jìn)步，時(shí)代也會(huì)不斷發(fā)展，相信未來會(huì)有更加清晰具體的倫理規(guī)則，干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)方面的研究也會(huì)極大地造福全人類。

二、拓展訓(xùn)練

科學(xué)家為研究24種基因在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的作用，分別將這些基因與病毒結(jié)合，構(gòu)造了24組重組病毒。利用這些重組病毒一起感染小鼠的成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為了多能干細(xì)胞。

(1)自體細(xì)胞誘導(dǎo)的干細(xì)胞在器官再生上具有很大優(yōu)勢(shì)，理論上可避免________。

(2)這些基因的序列已知，為獲取大量基因拷貝，一般采用________技術(shù)；病毒在此實(shí)驗(yàn)中的作用是作為________，將病毒和這些基因相連接還需要借助的兩種酶是____________________。

(3)為篩選出起關(guān)鍵作用的基因，科學(xué)家又做了24組實(shí)驗(yàn)，每次去掉一種重組病毒，分別觀察是否能夠成功誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這種自變量控制思路與下列________實(shí)驗(yàn)類似。

A.比較過氧化氫在不同條件下的分解實(shí)驗(yàn)

B.艾弗里肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

C.利用大腸桿菌證明DNA半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)

D.T2噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)

如果某基因在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，則去除這個(gè)基因?qū)?yīng)的重組病毒后，對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是

。

【答案】(1)免疫排斥反應(yīng) (2)PCR 載體 DNA連接酶和限制酶 (3)B 小鼠成纖維細(xì)胞無法轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞