2株野生木耳液體培養(yǎng)方法優(yōu)化及其胞內多糖的抗氧化活性分析

馮小飛 朗 丹

1 寸孟人1 胡珊苑1 余 浪1 楊 斌2

（1. 西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650233）

木耳屬(Auricularia)真菌是我國常見的野生食用菌，常生長于林間闊葉樹倒木及枯死木樁，由于其特殊的生物學特性，木耳屬真菌能夠分解多種材料中的纖維素、半纖維素、木質素等物質提供生長所需的營養(yǎng)[1-3]。木耳在我國栽培歷史悠久，從初期的椴木“砍花”栽培到如今的袋料菌棒培育已有1 000多年歷史[4]，經過食用菌工作者的努力和研究，木耳人工栽培技術目前已經趨于成熟，多篇文獻報道了菌種馴化、栽培種生產、替代基質篩選等方面的內容，為食用菌產業(yè)生產提供了較好的指導和借鑒[5-6]。黑木耳（Auriculoria auricular）和毛木耳（Auriculoria polytricho）是木耳屬真菌中常見的2個種，也是我國目前主要的木耳栽培品種，據(jù)吳芳等[2]的報道，早在2011年，我國黑木耳年產鮮質量就達到了346.1萬t，毛木耳年產鮮質量達到了143.5萬t。隨著木耳栽種規(guī)模的不斷擴大，每年對菌種的需求也越來越大，菌種的質量將直接影響著木耳產品的質量和產量。液體發(fā)酵培養(yǎng)技術是目前食用菌產業(yè)中菌種生產的主要方法，合適的發(fā)酵培養(yǎng)條件是菌種生產、真菌代謝產物開發(fā)過程中的重要保障[7-8]。盛思遠等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，向液體發(fā)酵培養(yǎng)基質中添加維生素B1和磷酸二氫鉀能夠顯著提高菌絲體中的抗氧化酶活性，從而緩解菌絲體的老化現(xiàn)象。于海洋等[10]利用正交實驗優(yōu)化了黑木耳的液體培養(yǎng)條件，通過條件優(yōu)化提高了黑木耳菌絲體的生物量和多糖含量。柴新義等[11]通過液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了黑木耳菌絲體對硒元素的富集效果。所以，開展木耳菌株液體培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化是促進木耳栽培及發(fā)酵產品開發(fā)的重要渠道。

多糖是木耳屬真菌中一類重要的化合物，廣泛存在于木耳子實體、菌絲體等組織中，近代研究表明，包括木耳在內的多種食用菌多糖是一類具有開發(fā)價值和利用潛力的天然化合物，對調節(jié)機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出了良好的活性[12-15]。例如，黑木耳中的水溶性多糖通過調節(jié)小鼠腸道微生物群落來降低由葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎[16-17]。角質木耳、毛木耳、黑木耳胞內多糖能夠顯著促進細胞增殖，對抗炎和抑菌表現(xiàn)出了較好的活性，同時，黑木耳子實體中的吡喃糖多糖還具有調節(jié)血脂保護肝臟的作用[18]。孫學明等[19]以心腦血管病人為研究對象，進行不同階段的黑木耳多糖攝入治療，通過病人的康復自愈能力分析結果發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖能夠促進心腦血管人體的康復。莊偉等[20]、許海林等[21]對黑木耳多糖進行了提取及結構解析并發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖可以通過促進巨噬細胞的增殖和吞噬能力，該作用在人體免疫調節(jié)方面具有廣闊的應用前景。

本研究以云南地區(qū)的野生黑木耳及毛木耳菌株為研究材料，通過液體搖瓶培養(yǎng)，研究不同碳源、氮源、無機鹽、pH值等因素對2株野生木耳菌絲體生長情況的影響，篩選出適合2株野生木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的營養(yǎng)添加物。同時對2株野生木耳菌絲體胞內多糖抗氧化活性進行了研究，為該地區(qū)野生木耳的人工栽培及產品開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

野生金江木耳菌株采自云南麗江市金江縣（99°75′12″E，27°22′42″N）栓皮櫟樹樁上，毛木耳采自云南昭通市大關縣三江口自然保護區(qū)（103°58′43″E，28°7′43″N）?！敖M 織分離法”對上述2種野生木耳子實體進行分離，菌絲萌發(fā)后經純化培養(yǎng)獲得純菌落，菌落及子實體經形態(tài)鑒定后，菌種保存于西南林業(yè)大學生命科學學院生物化學教研室，子實體及菌落如圖1所示。

圖 1 野生金江木耳、毛木耳子實體及菌絲培養(yǎng)照Fig. 1 The picture of subentity and mycelia cultured of wild Jingjiang's black fungus and A. polytricha

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和培養(yǎng)

將2種野生木耳菌種進行活化培養(yǎng)，無菌條件下接種于PDA培養(yǎng)基（直徑9 cm）中央，于(25 ± 2) ℃條件下培養(yǎng)8 d后備用。

1.2.2 基礎液體發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖2.0%，土豆20.0%，酵母浸膏0.3%，KH2PO40.1%，水1L，pH自然。

1.2.3 液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1）培養(yǎng)時間、溫度、pH值、碳源、氮源、無機鹽的篩選： 無菌條件下分別將2種野生木耳菌種打孔為大小相同的“菌餅”（直徑0.5 cm），接種至不同pH值（pH值為5、6、7、8、9）、不同碳源（蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、葡萄糖）、不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2SO4、酵母膏）、不同無機鹽（MgSO4、CaCl2、CuSO4、NaCl、KH2PO4）的基礎培養(yǎng)基中，于25 ℃，160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10 d；培養(yǎng)時間及溫度實驗將菌種接種至基礎培養(yǎng)基中，分別于25 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)不同天數(shù)（2、4、6、8、10 d）、以及不同溫度（20、25、30、35、40 ℃）條件下，160 r/min搖床培養(yǎng)10 d。每瓶發(fā)酵培養(yǎng)液接種6個菌餅（150 mL/瓶），每個單因素設置3個重復，按時取出不同培養(yǎng)條件的發(fā)酵培養(yǎng)物，過濾、洗滌，85 ℃烘4 h后稱重，記錄不同培養(yǎng)條件下2種木耳菌絲干質量。

2）正交實驗 在6個單因素實驗的基礎上，采用了L4（23）正交表對碳源、氮源、無機鹽、進行實驗設計，以獲得2種野生木耳最佳的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件。

1.2.4 菌絲體胞內多糖的提取

參照安雪菲等[22]方法，略有改動。分別取5.0 g粉碎處理的2種野生木耳菌絲體于50 mL離心管，加入20.0 mL水于80 ℃，800 W條件下超聲波提取10 min，離心收集上清液，重復提取3次后合并提取液。粗多糖提取液經過乙醇過夜沉淀，除蛋白后乙醇過夜二次沉淀，離心棄上清液，少量蒸餾水溶解，低溫處理后冷凍干燥儀凍干備用。

1.2.5 菌絲體胞內多糖抗氧化活性的測定

總還原力測定采用鐵氰化鉀還原法，以700 nm處樣品吸光值的大小評價還原力的強弱；羥基自由基（·OH-）清除能力采用水楊酸法測定；超氧陰離子（）清除能力采用鄰苯三酚自氧法測定；DPPH自由基（DPPH·）清除能力參考王倩朝等[23]、郭磊等[24]的方法測定。上述指標測定過程中以相同濃度抗壞血酸（Vc）為陽性對照，每組實驗重復3次。

式中：A0為空白對照液的吸光值，Ax為加入樣品溶液后的吸光值，Ax0為加入提取液后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件對測定數(shù)據(jù)進行處理和分析，結果以平均值 ± 標準差表示；以Excel軟件進行柱狀圖繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素篩選結果

2.1.1 時間對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

如圖2所示，2種野生木耳菌絲體干質量與培養(yǎng)時間均正相關的趨勢，野生金江木耳菌絲體生長較快，液體搖瓶培養(yǎng)6 d時菌絲體干質量達到了0.98 g，且在后續(xù)培養(yǎng)的3個時段中，菌絲體生物量變化不顯著，于10 d時菌絲體干質量最大為1.0 g。野生毛木耳菌絲體生物量隨著培養(yǎng)時間的增加而逐漸升高，10 d時，菌絲體干質量最大為0.89 g，顯著（P＜ 0.05）高于其他時段的質量。

圖 2 不同發(fā)酵培養(yǎng)時間對2株野生黑木耳菌絲體干質量的影響Fig. 2 Effects of different fermentation time on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.2 溫度對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

如圖3所示，2株野生木耳在20～35 ℃的溫度下都能夠正常生長，且菌絲體生物量隨著溫度的增加而呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，溫度為30 ℃時，野生金江木耳和毛木耳菌絲體生物量達到了最大，干質量分別為0.98 g和1.00 g。35 ℃后二者菌絲體干質量急劇下降，顯著低于20～30 ℃培養(yǎng)條件下的菌絲體質量（P＜0.05），40 ℃時供試木耳菌株不能正常萌發(fā)和生長。30 ℃是野生金江木耳和毛木耳液體搖瓶培養(yǎng)較為合適的培養(yǎng)溫度，當溫度超過35 ℃后，高溫影響了2株野生木耳菌絲體的正常生長和發(fā)育，造成菌絲體生物量降低，甚至菌種不能萌發(fā)和生長。

圖 3 不同發(fā)酵培養(yǎng)溫度對2株野生黑木耳菌絲體干質量的影響Fig. 3 Effects of different fermentation temperature on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.3 pH對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

如圖4所示，2株野生木耳在pH值5～9的范圍內都能夠正常生產，且菌絲體生物量隨著發(fā)酵液pH值的變化呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。當pH為7時，野生金江木耳和毛木耳菌絲體干質量最大，分別為0.86 g和1.04 g，顯著大于其他pH培養(yǎng)條件下的菌絲體干質量（P＜0.05）。pH值大于8以后供試木耳菌株菌絲體生物量顯著降低（P＜0.05），當pH為9時，2種木耳菌絲體干質量最小，僅為0.06 g和0.08 g。

圖 4 不同發(fā)酵培養(yǎng)pH值對2株野生黑木耳菌絲體干質量影響Fig. 4 Effects of different pH values on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.4 碳源對發(fā)酵培養(yǎng)的影響：

如圖5 所示，2株野生木耳菌株都能夠在5種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中正常生長，其中，葡萄糖為主要添加物時，二者菌絲體生物量均較大，分別為0.92 g（毛木耳）和0.89 g（金江木耳），其次為麥芽糖，且麥芽糖、果糖、蔗糖對毛木耳菌絲體干質量影響差異不顯著，以淀粉為碳源發(fā)酵培養(yǎng)時，供試的22株木耳菌株菌絲體生長狀況均較弱，菌絲體干質量僅為0.72 g（毛木耳）和0.61 g（金江木耳），顯著低于葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)結果（P＜0.05）。葡萄糖作為生命活動過程中最重要的單糖，具有溶解性好，能夠直接參與生物氧化反應提供能量，因此在本次單因素實驗中，葡萄糖為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)后2株木耳菌絲體生物量均較大。

圖 5 不同碳源對2株野生黑木耳菌絲體干質量的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.5 氮源對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

如圖6所示，2株野生木耳在生長過程中既能夠利用有機氮元素，同時也能夠利用無機氮源，添加蛋白胨時，2株野生木耳發(fā)酵后菌絲體干質量最大，分別為1.24 g（毛木耳）和0.87 g（金江木耳），牛肉膏的培養(yǎng)效果次之，供試菌株菌絲體干質量分別為 1.02 g（毛木耳）和0.84 g（金江木耳），雖然蛋白胨對供試野生木耳菌絲體的培養(yǎng)效果略優(yōu)于牛肉膏，但是二者對供試木耳菌絲體干質量影響差異不顯著。添加尿素為氮源時，2株野生木耳菌絲體生長情況較弱，菌絲體干質量分別為0.78 g（毛木耳）和0.68 g（金江木耳），與（NH4）2SO4相比，菌絲體干質量差異不顯著。蛋白胨、牛肉膏含有種類更為豐富的氨基酸、多肽、蛋白質等營養(yǎng)物質，所以添加蛋白胨進行液體發(fā)酵培養(yǎng)后能夠促進菌絲體生物量的積累，培養(yǎng)效果明顯比無機氮源好。

圖 6 不同氮源對22株野生黑木耳菌絲體干質量影響Fig. 6 Effects of different nitrogen sources on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.6 無機鹽對發(fā)酵培養(yǎng)的影響

如圖7所示，2株野生木耳在供試的5種無機鹽中都能夠正常生長，添加KH2PO4后，2種野生木耳菌絲體生長狀況均較好，菌絲體干質量分別達到了0.75 g（金江木耳）和0.65 g（毛木耳），顯著高于供試的其他無機鹽（P＜0.05）。同時，添加CuSO4后，金江木耳菌絲體干質量最小，僅為0.14 g，添加NaCl后，毛木耳菌絲體干質量最小僅為0.22 g。比較圖中數(shù)據(jù)可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加H2PO4能夠促進2株野生木耳菌株菌絲體的生長，提高菌絲生物量，同時，CuSO4和NaCl不利于2株木耳菌絲體的生長。

圖 7 不同無機鹽對2株野生黑木耳菌絲體干質量影響Fig. 7 Effects of different inorganic salts on dry weight of 2 wild A. auricular mycelia

2.1.7 正交實驗優(yōu)化結果

以碳源、氮源、無機鹽為主要考查因素，開展三因素二水平正交實驗，結果如表1和2所示。從表中可以看出，野生金江木耳菌絲體干質量最大為1.04 g/150 mL，野生毛木耳菌絲體干質量最大為1.26 g/150 mL。從極值（R）比較發(fā)現(xiàn)3個因素對供試木耳菌絲體干質量的影響順序為：氮源 ＞ 碳源 ＞ 無機鹽。所以，2株野生木耳優(yōu)化后液體發(fā)酵培養(yǎng)配方均為葡萄糖（2.0%）、蛋白胨（0.3%）、KH2PO4（0.1%）、土豆20.0%、初始pH值為7.0。

表 1 野生金江木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化結果Table 1 The optimization result of liquid fermentation culture conditions of wild Auricularia jingjiang fungus

表 2 野生毛木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化結果Table 2 The optimization result of liquid fermentation culture conditions of wild A. polytricha

2.2 2株野生木耳菌絲體胞內多糖抗氧化活性測定

2株野生木耳菌絲體胞內多糖抗氧化活性測定結果如表3所示，供試木耳菌絲體胞內多糖對·OH-、、DPPH·都表現(xiàn)出了一定的清除能力，且其抗氧化能力隨著濃度的增加而呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢。相同濃度條件下野生金江木耳菌絲體胞內多糖還原力的測定結果顯著高于野生毛木耳，但是二者均顯著低于陽性對照Vc的測定值（P＜0.05），濃度為0.50 mg/mL時，還原力測定值分別達到了0.47（金江木耳）和0.27（毛木耳）、1.62（Vc）?！H-清除率結果顯示，低濃度（0.10 mg/mL）時，2種野生木耳胞內多糖對·OH-的清除率差異不顯著，隨著濃度的增加，二者對·OH-的清除率逐漸增大，其中野生金江木耳菌絲體多糖的清除率顯著高于相同濃度下野生毛木耳的測定值（P＜0.05），濃度為0.50 mg/mL時，對·OH-的清除率分別為27.89%（金江木耳）和15.71%（毛木耳）、94.17%（Vc）。同時，2種野生木耳菌絲體胞內多糖對的清除效果差異不顯著，相同濃度下二者的清除率均顯著小于Vc的測定值（P＜0.05），濃 度 為0.50 mg/mL時，對的清除率最強，分別達到了70.60%（金江木耳）、71.58%（毛木耳）、87.21%（Vc）。由DPPH·清除率測定結果可知，低濃度時（0.10 mg/mL）22種野生木耳菌絲體胞內多糖的清除率均較小，且差異不顯著，隨著多糖濃度的升高，二者對DPPH·的清除效果逐漸升高，其中金江木耳樣品的清除效果顯著強于毛木耳（P＜0.05），清除率最高時分別達到了70.50%（金江木耳）和65.19%（毛木耳）。本次測定的4個抗氧化指標中，除了對清除率差異不顯著外，野生金江木耳菌絲體胞內多糖對其他3種抗氧化活性指標的測定值均顯著高于毛木耳，表現(xiàn)出了較好的抗氧化能力。

表 3 2株野生木耳菌絲體胞內多糖抗氧化能力測定結果Table 3 The antioxidant activity of intracellular polysaccharide in mycelium of 2 wild Auricularia strains

2.2.1 3種自由基半清除率（IC50值）的計算

由圖8可知，2株野生木耳菌絲體胞內多糖對DPPH·清除率效果最好，IC50值分別為0.40、0.39 mg/mL，的IC50值分別為0.43 mg/mL（野生金江木耳），0.42 mg/mL（野生毛木耳），二者對和DPPH·的IC50值差異不顯著。野生金江木耳菌絲體胞內多糖對·OH-的清除能力顯著強于毛木耳（P＜0.05），二者IC50值分別為0.67 mg/mL（金江木耳）和0.75 mg/mL（毛木耳）。綜合比較圖中數(shù)據(jù)可知，2株野生木耳菌絲體胞內多糖對DPPH·和的清除能力強于·OH-的清除能力。

圖 8 2株野生木耳菌絲體胞內多糖對三種自由基的IC50值Fig. 8 The IC50 values of intracellular polysaccharides of 2 wild Auricularia mycelia for 3 kinds of free radicals

3 結論與討論

菌絲體是真菌重要的營養(yǎng)組織，其生長狀況影響著真菌后期的生長發(fā)育和子實體的分化，培養(yǎng)條件，基質營養(yǎng)成分往往對菌絲體的形態(tài)和代謝產物產生重要的影響，所以培養(yǎng)條件優(yōu)化是菌種培育，發(fā)酵生產等多個領域中的重要環(huán)節(jié)[25-26]。本次實驗結果顯示，培養(yǎng)溫度30 ℃、pH值為7.0、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、添加KH2PO4條件下供試木耳菌株培養(yǎng)效果較好，其中野生金江木耳菌絲體生長速度較快，上述條件培養(yǎng)6 d時菌絲體干質量達到了1.04 g/150 mL（菌絲體生物量增長率為0.17 g/d），野生毛木耳生長相對較慢，發(fā)酵培養(yǎng)10 d后菌絲體干質量達到了1.26 g/150 mL（菌絲體生物量增長率為0.13 g/d）。碳源、氮源、無機鹽是微生物生長過程中不可或缺的營養(yǎng)物質，作為自然界中重要的單糖之一，葡萄糖直接參與糖酵解及三羧酸循環(huán)提供能量，與其他多糖或者二糖相比，葡萄糖無需水解，具有較高的利用率。蛋白胨為肉類、蛋白質類物質的酶水解物，含有豐富的小分子氨基酸和多肽，是一類重要的有機氮源，二者是微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中常用的營養(yǎng)添加物。例如：劉敏等[26]、李超等[27]、郭月仙等[28]分別對白背毛木耳(Auricularia polytricha)、黑木耳（Auricularia auricula）、玉木耳（Auricularia cornea）開展了培養(yǎng)條件研究，以葡萄糖為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)后，3種木耳菌絲體均獲得了較好的生物轉化率。車星星等[29]對黑木耳液體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、添加KH2PO4后黑木耳菌絲體生物量達到了1.63 g/100 mL，證實了以葡萄糖和蛋白胨為主要營養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方能夠提高木耳菌絲體的生物轉化率，但是由于不同品種之間生物學特性的差異，本次研究中2株野生木耳菌絲體生物轉化率略低于相關文獻報道?？寡趸瘻y定指標顯示，2種野生木耳菌絲體胞內多糖對鐵離子還原力、·OH-、、DPPH·都表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，且二者抗氧化效果與濃度呈現(xiàn)正相關趨勢。金江木耳對3種自由基的IC50值分別為0.67 mg/mL（·OH-）、0.40 mg/mL（DPPH·）、0.43 mg/mL（）；毛木耳對3種自由基的IC50值分別為0.75 mg/mL（·OH-）、0.39 mg/mL（DPPH·）、0.42 mg/mL（·），且 二者 對DPPH·和的 清除能力差異不顯著。以IC50值作為評價指標，金江木耳和毛木耳菌絲體孢內多糖對DPPH·的清除能力最強，二者IC50值均較小。木耳多糖是一類由醛糖或者酮糖通過糖苷鍵鏈接起來的多聚物，其抗氧化能力主要通過自由基清除及抗氧化酶活性的誘導實現(xiàn)[30]。羅敬文等[31]對玉木耳、黑木耳和毛木耳子實體多糖的抗氧化活性進行了研究，3種 木 耳 對·OH-的IC50值 在2.36～3.33 mg/mL之 間，的IC50值 在1.11～3.20 mg/mL之 間，DPPH·清除率的IC50值在1.32～10.34 mg/mL之間?？着骟薜萚23]研究結果也證實了黑木耳多糖具有抗氧化活性，從黑木耳子實體獲得的多糖對、DPPH·的IC50值分別為0.65、1.47 mg/mL，金江木耳及毛木耳菌絲體胞內多糖對三種自由基的IC50值均較小，表現(xiàn)出了較強的自由基清除能力。本次研究開展了2株野生木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化及菌絲體胞內多糖抗氧化活性的測定，研究結果對云南地區(qū)野生木耳資源的利用和開發(fā)提供理論依據(jù)及參考價值。