甲卡西酮及其代謝物在大鼠體內(nèi)的分布研究

楊秀秀，王學(xué)志，賀 強，于維光，王凌霄，張 潮， 王 濤，傅善林，贠克明,*，尉志文,*

（1.山西醫(yī)科大學(xué), 山西 晉中 030600；2.法庭毒物分析公安部重點實驗室，山西 晉中，030600； 3.澳大利亞悉尼科技大學(xué)法庭科學(xué)研究中心，澳大利亞 悉尼 NSW 2007）

近年來，甲卡西酮（methcathinone）作為合成卡西酮類新精神活性物質(zhì)的一種，在世界范圍內(nèi)的濫用趨勢逐漸上升[1-3]。從目前對于甲卡西酮的報道來看，國內(nèi)外學(xué)者主要就甲卡西酮的檢測、藥理學(xué)和毒理學(xué)作用、光學(xué)異構(gòu)體及其對顱內(nèi)刺激、學(xué)習(xí)記憶能力的影響等方面進行研究[2,4-9]。關(guān)于甲卡西酮代謝產(chǎn)物的研究，有學(xué)者報道了甲卡西酮通過肝微粒體孵育出卡西酮，也有關(guān)于甲卡西酮及其代謝物卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿的檢測方法，甲卡西酮的代謝途徑研究等[10-14]，而關(guān)于甲卡西酮及其代謝物麻黃堿在體內(nèi)的分布情況僅見于血漿和腦組織的研究[11]。因此，本實驗建立了甲卡西酮及其代謝物卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿在體內(nèi)分布研究的動物模型，觀察甲卡西酮及其代謝物在SD大鼠體內(nèi)的分布規(guī)律，為甲卡西酮中毒案件的檢材采取和法醫(yī)學(xué)鑒定提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260 液相色譜-Agilent 6460 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent，美國），Votex-genie2 渦旋混合器（Scientific Industries，美國），Neofuge 15R 高速冷凍離心機（上海力申科學(xué)儀器有限公司），Milli-Q 純水機（Millipore，美國）。

1.0mg/mL的S-甲卡西酮、S-卡西酮、S,R(+)-麻黃堿、R,R(+)-偽麻黃堿、S,S(+)-偽麻黃堿、氘代甲卡西酮（D3-Methcathinone）均購于美國Sigma-Aldrich；甲卡西酮動物實驗用藥（甲卡西酮含量95%）由公安部禁毒情報技術(shù)中心國家毒品實驗室提供，其余試劑均為色譜純。

1.2 標準溶液的配制

甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿標準品分別用甲醇稀釋至100 μg/mL，MC-D3內(nèi)標溶液用乙腈稀釋至 100 μg/mL，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 動物模型

雄性SD大鼠60只，體重220 g±20 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。大鼠禁食不禁水12 h，隨機分為A、B、C和對照組四組，每組6只。其中A、B、C組分別按照7.6、15.2、22.8 mg/kg經(jīng)腹腔注射甲卡西酮，對照組經(jīng)腹腔注射與A、B、C同等體積的生理鹽水1 mL[15]。各組大鼠分別于給藥后5、15、30 min處死，解剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃組織、肌肉、睪丸和心血置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待檢。以上動物實驗已通過山西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查。

1.4 樣本前處理

分別取固體檢材100 mg剪碎或血液100 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標 MC-D3（500 ng/mL） 10 μL，甲醇 500 μL，渦旋混合30 s，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速13 000 r/min冷凍離心 10 min，取上清液 400 μL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，過濾液取5 μL液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析[14]。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 Chiral- V（4.6 mm×100 mm×3.5 μm）；流動相：由含0.3%（質(zhì)量分數(shù)）甲酸銨的甲醇溶液與乙腈溶液（體積比為 40∶60）組成；流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：25 ℃；分析時間：9 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI+）；工作模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；各目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1中所示。

表1 目標化合物的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of targeted compounds

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS23. 0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和方差分析，結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 工作曲線

大鼠血液工作曲線：取空白血液樣本100 μL，加入梯度濃度的甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿工作液，配成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、250、500、1 000 ng/mL 的校正樣品，按 1.4 處理后進樣分析。結(jié)果見表2。

表2 血液中甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿的工作 曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Working curves and scopes of blood-harbored methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine

大鼠肝臟工作曲線：取空白肝臟樣本100 mg，加入梯度濃度的甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿工作液，配成質(zhì)量濃度為50、100、200、250、500、1 000、1 500、2 000 ng/g的校正樣品，按 1.4 處理后進樣分析。結(jié)果見表3。

表3 肝臟中甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿的工作 曲線相關(guān)參數(shù)Table 3 Working curves and scopes of liver-harbored methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine

2.2 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限與定量限

收集對照組6只大鼠的空白肝臟，進行基質(zhì)效應(yīng)的評估，配制50、500 ng/g和2 μg/g的低、中、高3個濃度的分析物標準溶液直接進樣，設(shè)定為a組；取對照組大鼠空白肝臟按1.4處理后，添加對應(yīng)濃度低、中、高3個濃度的分析物標準溶液進樣，設(shè)定為b組。比較兩組不同條件下的峰面積平均值（A），基質(zhì)效應(yīng)=Ab/Aa，結(jié)果見表4。使用空白肝臟添加標準工作液制作甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿梯度濃度為1、3、5、6、8、10、15、20 ng/g的基質(zhì)加標樣本后，按照前文所述進行提取與檢測，對所得色譜圖進行數(shù)據(jù)分析。所得目標峰信噪比（S/N） 等于3時的基質(zhì)加標濃度為最低檢出限（LLOD），S/N＝10時的濃度為最低定量限（LLOQ）。結(jié)果見表4。

表4 甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿的最低檢出限、最低定量限與基質(zhì)效應(yīng)Table 4 LLODs, LLOQs and matrix effects for the method to test methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine

2.3 精密度與準確度

每個批次中制作濃度分別為50 ng/g（工作曲線范圍下限）、500 ng/g（工作曲線范圍中段）和2 μg/g （工作曲線范圍上限）的質(zhì)控樣本，每個濃度制備6個平行樣本，共進行5個批次的處理與檢測。前3個批次分別在同一天內(nèi)的早、中、晚，進行樣品處理與檢測。后兩個批次分別在接下來的兩天的中午進行處理和檢測。

精密度以相對標準偏差（RSD）表示。所得的數(shù)據(jù)經(jīng)處理后得出各樣本的相對回收率（相對回收率＝工作曲線計算得濃度/理論濃度×100%），以各濃度的相對回收率的均值表示方法的批內(nèi)與批間準確度。評估批內(nèi)精密度、準確度與批間精密度、準確度的結(jié)果見表5。

表5 甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿的檢測方法的精密度和準確度Table 5 Precision and accuracy for the method to test methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine

2.4 選擇性

收集對照組6只大鼠的空白肝臟，進行選擇性的評估。其中空白基質(zhì)的檢測譜圖見圖1，在目標化合物的保留時間內(nèi)，無干擾峰。而通過單標的基質(zhì)加標譜圖（圖2、3），發(fā)現(xiàn)目標化合物之間也無互相干擾。

圖1 空白基質(zhì)的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of blank matrix

圖2 0.2μg/g的質(zhì)控樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of quality control sample at 0.2μg/g

圖3 0.2μg/g的質(zhì)控樣品的MRM圖Fig. 3 MRM spectrums of quality control sample at 0.2μg/g

2.5 甲卡西酮及其代謝物在大鼠體內(nèi)的分布

大鼠經(jīng)過不同劑量的甲卡西酮腹腔注射后，甲卡西酮原體及其代謝物卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿在其體內(nèi)的分布規(guī)律不同，不同組織臟器中甲卡西酮及其代謝物的濃度見表6～8。

甲卡西酮在三個劑量組下，不同時間點的含量變化為：在心、肺、腎、肌肉、腦、心血中，15 min的含量＞5 min的含量＞30 min的含量；肝中5 min的含量＞15 min的含量＞30 min的含量；在脾中，15.2和22.8 mg/kg劑量時5 min的含量＞15 min的含量＞30 min的含量，7.6 mg/kg時15 min的含量＞5 min的含量＞30 min的含量；睪丸中15 min的含量＞30 min的含量＞5 min的含量；在胃組織中，7.6 mg/kg時15 min的含量＞5 min的含量＞30 min的含 量，15.2 mg/kg時5min的含量＞15min的含量＞30min的含量，22.8 mg/kg時15min的含量＞30min的含量＞5min的含量。

卡西酮在三個劑量組下，不同時間點的含量變化為：在肺中，15.2和22.8 mg/kg劑量時30 min的含量＞15 min的含量＞5 min的含量，7.6 mg/kg時30 min的含量＞5 min的含量＞15 min的含量；在心、腎中，7.6和15.2 mg/kg劑量時30 min的含量＞15 min的含量＞5 min的含量，22.8 mg/kg時30 min的含量＞5 min的含量＞15 min的含量；脾、肌肉、腦、睪丸、胃組織、心血中，30 min的含量＞15 min的含量＞5 min的含量；在肝中，7.6和15.2 mg/kg劑量時5 min的含量＞30 min的含量＞15 min的含量，22.8 mg/kg時30 min的含量＞5 min的含量＞15 min的含量。

麻黃堿在三個劑量組下，不同時間點的含量變化為：在心、脾、腦、睪丸、胃組織、心血中相差不大（7.6 mg/kg時心、肌肉、胃組織均未檢出，睪丸和腦在5和15 min未檢出，脾在5 min未檢出；15.2 mg/kg 時心和肌肉均未檢出，腦在5 min未檢出；22.8 mg/kg 時肌肉在5和15 min未檢出，腦在5 min未檢出）；在腎中，15.2和22.8 mg/kg劑量時5 min的含量＞30 min的含量＞15 min的含量，7.6 mg/kg時30 min的含量＞5 min的含量＞15 min的含量；在肺中30 min的含量＞5 min的含量＞15 min的含量；在肝中5 min的含量＞30 min的含量＞15 min的含量。

偽麻黃堿在三個劑量組下，不同時間點的含量變化為：在肝、腎中15.2和22.8 mg/kg劑量時5 min的含量＞30 min的含量＞15 min的含量，7.6 mg/kg時5 min的含量＞15 min的含量＞30 min的含量；在肺中5 min的含量＞30 min的含量＞15 min的含量；在心、脾、腦、睪丸、胃組織、心血中含量相差不大（7.6 mg/kg時心、肌肉、胃組織未檢出，睪丸和腦在5和15 min未檢出；15.2 mg/kg時在15 min心和肌肉未檢出；22.8 mg/kg時在15min肌肉未檢出）。

表6 7.6mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿的分布（x±s）Table 6 Tissue distribution of methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 7.6mg/kg

表7 15.2mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿的分布（x±s）Table 7 Tissue distribution of methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 15.2mg/kg

表8 22.8mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿的分布（x±s）Table 8 Tissue distribution of methcathinone, cathinone, ephedrine and pseudoephedrine detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 22.8mg/kg

三個劑量組下不同時間點的含量分布結(jié)果見圖4～6。從圖中可以看出，甲卡西酮的含量分布特點主要為15 min的含量＞5 min的含量＞30 min的含量，卡西酮的含量分布特點主要為30 min的含量＞15 min的含量＞5 min的含量。麻黃堿、偽麻黃堿主要分布在腎、肝、肺，其余組織含量基本相同。

圖4 7.6mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮（a）、卡西酮（b）、麻黃堿（c）、偽麻黃堿（d）的組織分布Fig. 4 Tissue distribution of methcathinone (a), cathinone (b), ephedrine (c) and pseudoephedrine (d) detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 7.6 mg/kg

圖5 15.2mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮（a）、卡西酮（b）、麻黃堿（c）、偽麻黃堿（d）的組織分布Fig. 5 Tissue distribution of methcathinone (a), cathinone (b), ephedrine (c) and pseudoephedrine (d) detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 15.2 mg/kg

圖6 22.8mg/kg劑量下不同時間點中毒大鼠體內(nèi)甲卡西酮（a）、卡西酮（b）、麻黃堿（c）、偽麻黃堿（d）的組織分布Fig. 6 Tissue distribution of methcathinone (a), cathinone (b), ephedrine (c) and pseudoephedrine (d) detected at different time with the poisoned rats that were injected of methcathinone under a dose of 22.8 mg/kg

甲卡西酮和卡西酮在體內(nèi)的分布規(guī)律與劑量無關(guān)，僅與時間相關(guān)。注射后5 min，甲卡西酮在體內(nèi)的分布特點為：脾、腎＞肝、腦、胃組織＞肺＞心＞睪丸、肌肉、心血；卡西酮的分布特點為：腎、肝＞肺＞心、脾、腦、肌肉、胃組織＞睪丸、心血。注射后15 min，甲卡西酮的分布特點為：腎＞脾＞腦、胃組織、睪丸、肺、肝＞心、肌肉＞心血；卡西酮的分布特點為：腎＞肺、脾、肝＞腦＞胃組織、心、肌肉、心血＞睪丸。注射后30 min，甲卡西酮的分布特點為：腎＞脾＞胃組織、肺、腦、睪丸＞心、肝＞肌肉＞心血；卡西酮的分布特點為：腎＞胃組織＞肺＞肝、脾＞心、肌肉、腦＞睪丸、心血。

麻黃堿和偽麻黃堿在體內(nèi)的分布規(guī)律不但與時間相關(guān)，而且與劑量相關(guān)。注射后5 min，麻黃堿的分布特點為：7.6 mg/kg劑量組腎、肝＞肺＞心血，在心、脾、肌肉、腦、睪丸、胃組織中未檢出；15.2 mg/kg劑量組腎、肝＞肺＞脾、睪丸、胃組織、心血，在心、肌肉、腦中未檢出；22.8 mg/kg劑量組肝、腎、肺＞脾、睪丸＞心血、胃組織、心，在肌肉、腦中未檢出。偽麻黃堿的分布特點為：7.6 mg/kg 劑量組肝、腎＞肺＞脾、心血，在心、肌肉、腦、睪丸、胃組織中未檢出；15.2、22.8 mg/kg劑量組肝、腎＞肺＞脾、睪丸、腦、胃組織＞心血、心、肌肉。注射后15 min，麻黃堿的分布特點為：7.6 mg/kg劑量組腎＞肝＞肺＞心血、脾，在腦、心、肌肉、胃組織和睪丸中未檢出；15.2、22.8 mg/kg劑量組腎＞肝＞肺＞脾＞胃組織、睪丸＞心血、腦＞心，在肌肉中未檢出。偽麻黃堿的分布趨勢為：7.6 mg/kg劑量組腎＞肝＞肺＞心血、脾，在腦、心、肌肉、胃組織和睪丸中未檢出；15.2、22.8 mg/kg劑量組腎＞ 肝＞肺＞脾＞胃組織、睪丸＞心血、腦＞心，在肌肉中未檢出。注射后30 min，麻黃堿的分布特點為：7.6 mg/kg劑量組腎、肝、肺＞脾、睪丸＞心血、腦，在心、肌肉、胃組織中未檢出；15.2 mg/kg劑量組腎、肝、肺＞脾、睪丸、胃組織、腦、心血，在心、肌肉中未檢出；22.8 mg/kg劑量組腎、肝、肺＞胃組織、脾、睪丸、腦＞肌肉、心、心血。偽麻黃堿的分布特點為：7.6 mg/kg劑量組腎、肺、肝＞睪丸、腦、心血，在心、脾、肌肉、胃組織中未檢出；15.2、22.8 mg/kg劑量組腎、肝、肺＞睪丸、脾、腦、胃組織＞心血、心、肌肉。

通過以上結(jié)果，可以得出在相同時間點，各個劑量組內(nèi)，甲卡西酮及其代謝物在體內(nèi)的分布均為在腎中的含量最高。

3 討論

3.1 體內(nèi)分布模型建立

本研究建立了甲卡西酮染毒大鼠的體內(nèi)分布模型。大鼠經(jīng)腹腔注射不同劑量的甲卡西酮后于5、15、30 min處死，研究體內(nèi)各臟器中藥物的分布狀態(tài)與劑量、時間的關(guān)系。通過前期的研究發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)過甲卡西酮腹腔注射后在血液中的甲卡西酮原體含量的達峰時間是15 min，半衰期是30 min，為了研究甲卡西酮及其代謝物卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿在體內(nèi)的大致分布狀態(tài)，在甲卡西酮腹腔注射5、15、30 min時處死。此模型簡單易復(fù)制，可應(yīng)用于甲卡西酮的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究[16]。

3.2 分布規(guī)律

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，甲卡西酮、卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿在體內(nèi)臟器的分布規(guī)律與劑量關(guān)系不大。甲卡西酮及代謝物卡西酮、麻黃堿、偽麻黃堿在體內(nèi)的分布均是在腎臟內(nèi)含量最高，而在各臟器的分布中甲卡西酮原體的含量是最高的，卡西酮次之，麻黃堿和偽麻黃堿的含量很少。其中，麻黃堿和偽麻黃堿在體內(nèi)臟器中的檢出是與劑量相關(guān)的。在不同劑量和不同時間點下，血液中的甲卡西酮及卡西酮在各劑量下的含量均遠高于定量限，血液中麻黃堿和偽麻黃堿在各劑量下的含量均在檢出限附近，以上結(jié)果提示，在疑似甲卡西酮吸毒或死亡的案件中，血液可以作為檢測相關(guān)人員是否吸毒的檢材，但應(yīng)注意需要同時檢測出甲卡西酮原體及其代謝物才可作為判定吸毒的依據(jù)。

藥（毒）物在體內(nèi)的分布是受多種復(fù)雜因素影響的動態(tài)變化過程，影響因素包括藥（毒）物的脂溶性、毛細血管通透性、器官和組織血流量、與血漿蛋白和組織蛋白的結(jié)合能力、藥物pKa和局部pH值、藥物轉(zhuǎn)運載體數(shù)量和功能狀態(tài)、特殊組織膜的屏障作用等[16]。

從總體分析來看，甲卡西酮及其代謝物在腎、脾、肝、肺等臟器中的含量較高，而在心、心血、肌肉等組織中的含量較低。甲卡西酮的脂溶性較高，從以上分析來看，其含量在體內(nèi)的分布受脂溶性的影響較高。因而，在實際甲卡西酮中毒案件中，檢材提取應(yīng)以腎、脾、肝、肺等作為毒物分析的檢材。

4 結(jié)論

本研究建立的方法前處理簡便，通過有機溶劑沉淀蛋白而實現(xiàn)對目標物質(zhì)的檢測。該方法實現(xiàn)了同時對甲卡西酮及其代謝物卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿的定性定量分析。方法的靈敏度和檢出限都較好，有利于對此類案件進行快速檢測。通過以上分析結(jié)果可以得出，在不同劑量以及不同時間點下甲卡西酮及其代謝物卡西酮、麻黃堿和偽麻黃堿在腎中的含量均高于其他內(nèi)臟組織，因而提示在實際案件中應(yīng)提取以腎為主的檢材進行分析檢測。