馬氏珠母貝黏液糖蛋白組成及其體外抗癌活性研究

歐陽(yáng)彤，余 蔚，尚壯壯，任鼎鼎，伍 彬，2，鄭惠娜，2，3

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

馬氏珠母貝（Pinctada martensii），又稱合浦珠母貝、珍珠母，是我國(guó)南海最重要的海水養(yǎng)殖珍珠貝類[1]。然而，產(chǎn)珠后的珠母貝貝殼、臟器及黏液等資源未獲得充分利用。為了進(jìn)一步提高此部分資源的開發(fā)利用，增加珍珠產(chǎn)業(yè)的附加值，諸多學(xué)者對(duì)馬氏珠母貝產(chǎn)珠后的副產(chǎn)物進(jìn)行了深入研究。司蕊等人[2]研究指出，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)含量豐富且必需氨基酸含量高，富含?；撬?、微量元素鋅（Zn）和硒（Se）。葉植波等人[3]率先以馬氏珠母貝黏液為原料并從中提取出天然?；撬?，為天然?；撬崽崛√峁┝诵滤悸贰Ｕn題組前期對(duì)馬氏珠母貝黏液糖蛋白的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明馬氏珠母貝黏液糖蛋白對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除能力[4]。此外，馬氏珠母貝貝肉所具有的抗衰老、抗氧化、降血壓、護(hù)肝醒酒、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等顯著生理功能活性作用的成分被一一驗(yàn)證，闡明了馬氏珠母貝產(chǎn)珠后副產(chǎn)物的高附加值應(yīng)用潛力[5]。

糖蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，是一種由寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合所形成具有特定功能活性的一類結(jié)合蛋白，糖鏈結(jié)構(gòu)為糖蛋白的功能核心，不同種類的寡糖鏈及與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式組成了生物體內(nèi)酶、激素、凝集素、載體、抗體等，并且生物體中超過50%蛋白質(zhì)具有糖基化修飾[6-8]。Go H等人[9]在研究糖蛋白過程中發(fā)現(xiàn)，從食物物料中通過分離手段得到的糖蛋白仍能表現(xiàn)出顯著的抗氧化、抗腫瘤生理活性，同時(shí)指出生物體內(nèi)的糖蛋白可能具有功能的獨(dú)立性和穩(wěn)定性。得益于生物組學(xué)、糖生物學(xué)和分離純化技術(shù)的發(fā)展，將生物體內(nèi)糖蛋白提取純化后并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和活性評(píng)價(jià)已成為了生物功效成分提取的新方向[10-11]。糖蛋白的來源分為植物源性與動(dòng)物源性，由于植物源性糖蛋白提取中存在著藥理活性不確定因素，使得其在中藥材等方面的應(yīng)用較局限，而動(dòng)物源糖蛋白的提取多被作為提升實(shí)際生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的附加值手段之一[12-13]。在打造“藍(lán)色糧倉(cāng)”的當(dāng)下，越來越多海洋生物源糖蛋白的生理活性被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，徐偉良等人[14]以大鯢皮膚黏液為原料通過分離純化手段提取出了糖蛋白純品，并通過細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該糖蛋白具有顯著的抗肺癌活性。對(duì)馬氏珠母貝黏液糖蛋白進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)分析，并通過體外細(xì)胞試驗(yàn)初步確定馬氏珠母貝黏液糖蛋白具有抗癌活性組分，研究結(jié)果為進(jìn)一步提升馬氏珠母貝副產(chǎn)物附加值提供新思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝來源于廣東省雷州市珍珠貝養(yǎng)殖場(chǎng)，將黏液分離出來，于4℃下以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于塑料瓶中，于-30℃下凍藏備用。Sephadex G-150柱層析，北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供；美國(guó)USA進(jìn)口透析袋，截留分子量為1 000 Da，上海橋星貿(mào)易有限公司提供；SDSPAGE凝膠快速配制試劑盒、彩色預(yù)染蛋白Marker（6.5～270 kDa）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 （5×）、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly，Powder）、考馬斯亮藍(lán)染色液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；MTT，上海源葉生物科技有限公司提供；南美胎牛血清、DMEM basic、0.25% Trpsin-EDTA，美國(guó)Gibco公司提供；Dimethyl sulfoxide，美國(guó)Sigma公司提供；乙二胺四乙酸二鈉鹽、二水、碳酸氫鈉、無水乙醇、氯化鈉、冰乙酸、D-無水葡萄糖、苯酚、硫酸、異丙醇、溴化鉀、二甲基亞砜，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RC-6 plus型落地式高速冷凍離心機(jī)、ND 2000C型超微量紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Advantage A10型超純水器，德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Q10A型電陶爐，廣東新功電器有限公司產(chǎn)品；Quintix1102百分之一天平、Quintix224萬分之一天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Cool Safe 100-4型真空凍干系統(tǒng)，丹麥LABOGENE產(chǎn)品；HL-2型數(shù)字恒流泵、BS-100A型自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠產(chǎn)品；AP-9925型真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Mini PROTEAN型電泳槽、Power Basic型電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；NSP-300型水平旋轉(zhuǎn)儀，泰州諾米醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)BRUKER公司產(chǎn)品；SQ510C型高壓滅菌鍋，日本YAMATO公司產(chǎn)品；DHG-9070A型精密鼓風(fēng)干燥箱，中國(guó)BIOBASE公司產(chǎn)品；BC-J160型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、SW-CJ-FD型凈化工作臺(tái)、HHS-11-1型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；DM0412型低速離心機(jī)，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司產(chǎn)品；XD型細(xì)胞培養(yǎng)用顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn)品；Synergy HT型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬氏珠母貝黏液糖蛋白的粗提

將馬氏珠母貝黏液解凍，透析24 h，采用30%的聚乙二醇濃縮4 h，然后采用直接醇沉法對(duì)透析、濃縮后的馬氏珠母貝黏液進(jìn)行粗提[5]，取適量黏液于燒杯中，加入90%的乙醇溶液至乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，緩慢攪勻后于4℃冰箱中靜置18 h，棄去上清液，將沉淀物于4℃下以轉(zhuǎn)速7 000 r/min離心15 min，取沉淀暴露在空氣中至乙醇味消散，真空冷凍24 h得糖蛋白粗品DAS。

1.3.2 糖蛋白的分離純化

采用Sephadex G-150柱層析法對(duì)透析、醇沉后的糖蛋白粗品進(jìn)行分離純化[5]。層析柱規(guī)格為φ1.6 cm×60 cm；將糖蛋白粗品溶于超純水，于4℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，過0.22 μm的水系微孔濾膜，調(diào)節(jié)可溶性蛋白含量為6～8 mg/mL，每次上樣4 mL。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的NaCl洗脫液為流動(dòng)相，以1 mL/min的流速進(jìn)行純化，每管收集5 mL，于波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度并繪制分離純化曲線，對(duì)出現(xiàn)的峰進(jìn)行分開收集，真空冷凍干燥24 h，得糖蛋白純化品。

1.3.3 SDS-PAGE電泳

使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，將膠板固定于電泳槽的凹槽內(nèi)，使電泳膠完全浸泡于電泳液中，調(diào)整樣品蛋白質(zhì)量濃度至1 mg/mL[5]，上樣10 μL，彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品上樣7 μL，調(diào)節(jié)電壓為120 V，電泳1～2 h，待條帶跑至電泳膠底部關(guān)閉電源，將電泳膠完整取出，振蕩染色2 h，脫色5～6 h至條帶清晰可見，將脫色后的電泳膠進(jìn)行拍照，采用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件計(jì)算分子質(zhì)量分布。

1.3.4 糖含量、氨基酸測(cè)定

總糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法[15-16]。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.069X+0.062 4，R2=0.982 5。分別取0.5 mg/mL的粗品，0.3 mg/mL的純化品1.0 mL于2只試管中，按相同步驟測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品糖含量，見公式（1）：

式中：w——樣品的糖含量，%；

m1——樣品的糖的質(zhì)量，g；

M——樣品有效成分的質(zhì)量，g。

樣品水解氨基酸測(cè)定采用GB 5009.124—2016[17]。

1.3.5 紅外光譜測(cè)定

紅外光譜測(cè)定采用溴化鉀壓片法[18]。取適量溴化鉀、糖蛋白純化品分開置于潔凈的玻璃皿上，放入紅外線快速干燥器烘2～3 h直至烘干，按糖蛋白樣品∶溴化鉀=1∶100的比例置于瑪瑙缽體中研磨成面粉狀且無晶體的細(xì)粉，用壓片機(jī)制成透光性良好的薄片，每種樣品設(shè)置3個(gè)平行，1組空白，采用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定糖蛋白樣品的紅外圖譜。

1.3.6 糖蛋白的體外抗癌活性檢測(cè)

采用四氮唑藍(lán)還原（MTT）法測(cè)定糖蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）、小鼠肺癌細(xì)胞（LLC） 的抑制率。即細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至倍數(shù)生長(zhǎng)期后，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104mL-1，種于96孔板，按質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)12 h待其貼壁后，加入一定質(zhì)量濃度梯度的糖蛋白溶液，最終質(zhì)量濃度梯度為0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mg/mL，作用24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL裂解液DMSO，小心振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度，按公式（2） 計(jì)算糖蛋白純化品對(duì)HepG2、LLC細(xì)胞的增殖抑制率，分析糖蛋白的生物活性作用。

1.3.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行方差（ANOVA）顯著性（p＜0.05） 以及回歸Probit分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G-150柱層析法純化結(jié)果

珍珠貝黏液經(jīng)過透析除鹽、乙醇沉淀后得到糖蛋白粗品，再通過Sephadex G-150進(jìn)行分離純化，洗脫曲線在波長(zhǎng)280 nm處呈現(xiàn)2個(gè)吸收峰，分別收集2個(gè)吸收峰的洗脫液，真空凍干后得糖蛋白純化品MP-FI、MP-FII。

DAS的Sephadex G-150柱層析洗脫曲線見圖1。

圖1 DAS的Sephadex G-150柱層析洗脫曲線

2.2 SDS-PAGE電泳圖譜分析

MP-FI和MP-FII的電泳圖見圖2。

圖2 MP-FI和MP-FII的電泳圖

由圖2可知，MP-FI在6.7，18.0，34.0，39.0，164.0 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶，其中含量最高的蛋白組分分子量在39 kDa附近。與余蔚等人[4]研究得到的245 kDa糖蛋白分子量存在差異，可能是黏液批次和分離純化條件不同所導(dǎo)致。MP-FI中除了含量較高的39 kDa的蛋白組分，還含有其他雜蛋白，通過一步分離純化方法較難到單一的糖蛋白純化品。MP-FII在SDS-PAGE上形成的條帶較淡，可能含有分子量小于6.5 kDa的蛋白或其他低分子肽，其中較明顯的蛋白條帶出現(xiàn)在121 kDa附近。

2.3 糖含量、氨基酸組成分析

結(jié)構(gòu)決定功能，糖肽鍵是由糖分子中碳原子上連接的醇羥基與氨基酸氨基脫水縮合或羥基脫去一分子水所形成，是糖蛋白的功能活性中心[19]。根據(jù)糖鏈與氨基酸連接方式和位點(diǎn)的不同可以將糖蛋白分為O-糖基化糖蛋白和N-糖基化糖蛋白，且可形成糖肽鍵的氨基酸殘基主要為天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Se）r、蘇氨酸（Th）r等，其中絲氨酸與蘇氨酸與糖鏈分子以O(shè)-連接方式連接，而天冬氨酸與糖鏈分子主要通過C-N共價(jià)連接方式進(jìn)行連接[20-21]。試驗(yàn)測(cè)得MP-FI有效成分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.59%±0.34%，可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.33%±5.30%；MP-FII有效成分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.06%±0.15%，可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.88%±5.27%。

氨基酸組成及百分含量（%，n=2） 見表1。

表1 氨基酸組成及百分含量（%，n=2）

由表1可知，MP-FI和MP-FII氨基酸種類豐富，均含有16種水解氨基酸，其中包含7種必需氨基酸：蘇氨酸（THR）、纈氨酸（VAL）、蛋氨酸（MET）、異亮氨酸（ILE）、亮氨酸（LEU）、苯丙氨酸（PHE）、賴氨酸（LYS），MP-FI和MP-FII中必需氨基酸的含量分別占水解氨基酸總量的36.86%和29.92%。近年來研究發(fā)現(xiàn)，具有抗癌活性的蛋白肽具有相似的賴氨酸、組氨酸及精氨酸的組成成分[22]。有研究發(fā)現(xiàn)癌癥細(xì)胞具有大量吸取必需氨基酸的特征[23-24]。

2.4 紅外光譜測(cè)定結(jié)果

采用傅里葉紅外光譜法對(duì)純品MP-FI、MP-FII的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析。

MP-FI、MP-FII的紅外光譜圖見圖3。

圖3 MP-FI、MP-FII的紅外光譜圖

由圖3可知，對(duì)比MP-FI與MP-FII 2種純化品的紅外光譜曲線，在酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）、酰胺III帶（1 220～1 330 cm-1）2種純化品存在明顯差異，說明MP-FI與MP-FII二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異。其中MP-FI在1 653 cm-1處具有強(qiáng)特征吸收峰，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，根據(jù)Zhao Z K等人[25]在應(yīng)用FTIR測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中指出蛋白質(zhì)分子中α折疊數(shù)量與分子內(nèi)氫鍵數(shù)量呈正相關(guān)，可推測(cè)出MP-FI樣品分子結(jié)構(gòu)中含有更多的氫鍵；同時(shí)，在1 541 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰代表在MP-FI中的N-H彎曲振動(dòng)與C-N伸縮振動(dòng)。MP-FII在1 647 cm-1處出現(xiàn)特征吸收，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在無規(guī)則卷曲，且MP-FII在1 456 cm-1出現(xiàn)特征吸收峰，代表著其結(jié)構(gòu)內(nèi)的C-H（O）C-O彎曲伸縮振動(dòng)[26]。MP-FI、MP-FII在2 342，2 361，2 961 cm-1均出現(xiàn)吸收峰且頻率相似，說明2種純化蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，而在3 296，3 422 cm-1處的吸收峰（O-H）、2 961 cm-1處的吸收峰（C-H） 和1 396 cm-1處的吸收峰（C-H）均為糖類的特征吸收峰，說明了MP-FI、MP-FII肽鏈結(jié)構(gòu)存在差異，且MP-FI在1 040 cm-1處的吸收峰表示其糖鏈結(jié)構(gòu)中存在β-型糖苷鍵結(jié)構(gòu)[27]。

2.5 體外抗癌活性

MP-FI、MP-FII對(duì)HepG2的抑制率見圖4，MPFI、MP-FII對(duì)LLC的抑制率見圖5。

圖4 MP-FI、MP-FII對(duì)HepG2的抑制率

圖5 MP-FI、MP-FII對(duì)LLC的抑制率

由圖4可知，糖蛋白純化品MP-FI對(duì)人肝癌（HepG2） 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。隨著質(zhì)量濃度的增大，MP-FI對(duì)HepG2的抑制率逐漸增大，在1～4 mg/mL表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性（p＜0.05），當(dāng)MP-FI質(zhì)量濃度達(dá)6 mg/mL時(shí)，對(duì)HepG2的抑制率高達(dá)61.56%，IC50值為2.7 mg/mL。MP-FII在0.5～6.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用，但無顯著性差異（p＞0.05）。由圖5可知，MP-FI對(duì)小鼠肺癌（LLC） 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用，在低質(zhì)量濃度（0.5～2.0 mg/mL）范圍內(nèi)無顯著性差異（p＞0.05），在2～6 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性（p＜0.05），當(dāng)MP-FI質(zhì)量濃度達(dá)6 mg/mL時(shí)，對(duì)LLC的抑制率達(dá)42.23%，IC50值為12.1 mg/mL?？傮w分析可知糖蛋白純化品MP-FI的抗癌活性明顯強(qiáng)于MP-FII（p＜0.05）。

細(xì)胞大量積累自由基是導(dǎo)致其發(fā)生癌變的主要原因之一，且研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生癌變的細(xì)胞內(nèi)含有更多的自由基，而這些自由基通過損傷細(xì)胞內(nèi)部的DNA使正常良性腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展成為惡性癌細(xì)胞，具有清除自由基的物質(zhì)能夠?qū)Π┘?xì)胞產(chǎn)生抗性作用[28]。在前期的研究中，證實(shí)了馬氏珠母貝黏液糖蛋白具有顯著的抗氧化清除自由基的能力[5]，MP-FI與MP-FII對(duì)2種癌細(xì)胞的抑制作用可能與其所具有的體外抗氧化活性密切相關(guān)。

3 結(jié)論

MP-FI和MP-FII含有的氨基酸種類豐富，含有較高的與抗癌功能活性相關(guān)的賴氨酸和精氨酸。MP-FI的分子量分布集中為6.7～39 kDa。MP-FI、MP-FII的化學(xué)結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成存在差異，且根據(jù)MP-FI特征吸收峰確定了其存在區(qū)別于MP-FII的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，MP-FI和MP-FII均具有多糖的特征吸收峰，其中MP-FI中具有β-型糖苷鍵的結(jié)構(gòu)。MP-FI、MP-FII均具有一定的抗癌活性，且MP-FI對(duì)HepG2、LLC的抑制作用明顯高于MP-FII。研究結(jié)果可為進(jìn)一步利用馬氏珠母貝黏液開發(fā)具有抗癌活性功能的制品提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。