酶促小分子化合物β-糖基化研究進(jìn)展

周家偉，胡友明，陸躍樂，朱林江，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

糖基化修飾廣泛存在于天然化合物中，其可有效提高天然化合物的水溶性和生物活性[1]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值。由于形成糖苷的單糖有α-和β-兩種構(gòu)象的端基異構(gòu)體，所以在形成糖苷化合物時會產(chǎn)生2種不同構(gòu)型的糖苷，即α-糖苷和β-糖苷。不同構(gòu)型的糖苷通常表現(xiàn)出不同的物理化學(xué)性質(zhì)以及生物活性，例如，與L-薄荷醇-α-葡萄糖苷相比，L-薄荷醇-β-葡萄糖苷表現(xiàn)出更高的水溶解性，更好的清涼感和皮膚滲透性[2]。

利用化學(xué)法合成小分子化合物糖苷的方法已被廣泛應(yīng)用，比如L-薄荷醇-β-葡萄糖苷、香蘭素、乙基香蘭素-β-葡萄糖苷和香葉醇-β-葡萄糖苷等等，但化學(xué)法往往需要繁瑣的保護和去保護步驟，且涉及重金屬催化劑，容易產(chǎn)生大量的污染物。此外，化學(xué)法的區(qū)域選擇性和立體選擇性也較差。相比之下，生物酶法糖基化通?？梢徊綄崿F(xiàn)端基異構(gòu)體構(gòu)型的糖基化，包括α-糖基化和β-糖基化，且具有良好的區(qū)域選擇性[3]。其中，酶法合成α-糖苷被報道的相對較多，比如α-糖苷酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖磷酸化酶。這種方法能以廉價原料為糖基供體，可有效地糖基化多種小分子化合物生產(chǎn)α-糖苷產(chǎn)物[4]。近些年來，一些小分子化合物的酶法合成β-糖苷也被相繼報道，比如，低聚β-半乳糖、烷基-β-糖苷等的合成，如圖1所示。已報道的相關(guān)的β-糖基化酶在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(carbohydrate-actie enzymes, CAZy)中主要分布于糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)家族和糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase, GT)家族[5-6]。其中，GT催化合成β-糖苷的效率較高，但其糖基供體價格昂貴；而GH糖基供體廉價，底物廣泛，其作為小分子化合物的β-糖基化酶，具備一定的應(yīng)用價值。

圖1 酶法合成的小分子化合物β-糖苷Fig.1 β-Glycoside of small molecule compounds synthesized by enzymatic method

1 β-異頭選擇性糖基化的反應(yīng)類型

許多已商業(yè)化的小分子化合物的β-糖苷是由化學(xué)法合成，主要由4步反應(yīng)組成。首先是葡萄糖的保護反應(yīng)，即由乙酸酐和碘過氧乙?；?，生成β-五乙酰糖；再與HBr/AcOH在葡萄糖的異頭過氧乙?；恢名u化，生成鹵化的β-乙酰化糖，目標(biāo)糖基受體底物與Lewis酸催化的活化糖基供體反應(yīng)，生成β-乙酰化糖苷；最后，經(jīng)甲醇鈉催化去保護反應(yīng)，形成目標(biāo)化合物的β-糖苷產(chǎn)物[7]。

在酶法催化β-異頭選擇性糖基化反應(yīng)方面，根據(jù)催化作用機制的不同可分為2類：反轉(zhuǎn)型和保留型(圖2)。

a-反轉(zhuǎn)機制;b-保留機制圖2 β-糖基化酶的2種催化機制Fig.2 Two catalytic mechanisms of β-glycosylase

反轉(zhuǎn)型反應(yīng)機制通常為一步催化(圖2-a)，由α-糖苷原料作為糖基供體合成β-糖苷產(chǎn)物。催化過程中，糖基受體作為親核試劑被活化，用于直接置換并反轉(zhuǎn)異頭取代基，形成反轉(zhuǎn)的糖苷鍵。保留型反應(yīng)機制(圖2-b)常分為2步，第一步以酶的一個催化殘基作為親核試劑，攻擊異頭中心以取代苷元R1并形成α-糖基酶中間體，同時其他殘基起到酸催化劑的作用，并在鍵斷裂時使糖苷氧質(zhì)子化；第二步中，另一個催化殘基充當(dāng)堿催化劑，在另一個含有羥基的小分子化合物R2攻擊下使糖基酶中間體去質(zhì)子化，形成β-糖基化合物[8]。

2 具有β-糖基化反應(yīng)的酶

2.1 糖苷水解酶

糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)又稱糖苷酶，能夠催化糖與糖或糖與其他苷元之間糖苷鍵水解的酶。此外，其中一些酶還具有轉(zhuǎn)糖基活性，即可對小分子化合物進(jìn)行糖基化修飾。其中催化β-糖苷合成的GH主要分布于GH13、GH16、GH68、GH70和GH77這5個家族中。自上世紀(jì)末，AJISAKA等[9]利用杏仁的β-葡萄糖苷酶在90%的葡萄糖溶液中合成4種β-糖苷鍵連接的葡萄糖二糖以來，研究人員發(fā)現(xiàn)了許多GH能催化β-糖苷化合物的合成[10]。

不同來源的β-糖苷酶具有不同的催化特性、不同的糖基供體和受體底物，例如Bacilluscirculans來源的β-半乳糖苷酶合成具有β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)和β-(1→6)連接的低聚糖，而Geobacillusstearothermophilus和Bifidobacteriuminfantis來源的β-半乳糖苷酶主要產(chǎn)生β-(1→3)連接的低聚糖，Kluyeromyceslactis來源的β-半乳糖苷酶則主要產(chǎn)生β-(1→4)糖苷鍵。除此之外，不同來源的酶的受體和供體底物的選擇性也有所不同，如表1所示。

表1 β-糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)與底物特異性Table 1 β-Glycosidase enzyme properties and substrate specificity

續(xù)表1

低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)是益生元的一種，能夠選擇性的刺激腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、提高機體免疫力等作用。廣泛存在于一系列微生物中的具有轉(zhuǎn)半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶是GOS生物合成的良好催化劑，其催化乳糖水解與轉(zhuǎn)半乳糖基化生成GOS，最高產(chǎn)量達(dá)到315 g/L[11]。有研究表明，在所有真菌來源的β-半乳糖苷酶中，Aspergillusoryzae產(chǎn)生的GOS濃度最高。而在細(xì)菌中，早期的研究表明Bacilluscirculans來源的β-半乳糖苷酶可實現(xiàn)高效生產(chǎn)GOS[12]。

除了GOS外，近年來研究發(fā)現(xiàn)β-糖基化酶對多種潛香化合物、脂肪醇和維生素類化合物也顯示出轉(zhuǎn)糖基活性[13-14]。隨著天然酶數(shù)據(jù)庫的不斷擴大，有研究發(fā)現(xiàn)一種具有新型糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶lasGT。有趣的是，具有2種異頭構(gòu)型的各種芳基和烷基葡萄糖苷都是該酶的底物[15]。

2.2 糖苷磷酸化酶

糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylases, GPs)，能夠可逆地催化糖苷鍵的形成和斷裂，其可使用穩(wěn)定的糖磷酸為糖基供體，將糖基轉(zhuǎn)移到特定的糖受體上。這種獨特的可逆反應(yīng)優(yōu)勢，加上嚴(yán)格的區(qū)域選擇性，且能夠使用單糖磷酸作為活性糖基供體，使GP成為有價值的合成β-糖苷的催化劑。最近報道了一些GP在合成復(fù)雜糖苷中的應(yīng)用，其中包括合成β-構(gòu)型的二糖和寡糖等，如表2所示。

表2 糖苷磷酸化酶酶學(xué)性質(zhì)與底物特異性Table 2 Enzymatic properties and substrate specificity of glycoside phosphorylase

目前鑒定的GP的底物多樣性相對較小，限制了它們的實際應(yīng)用。有研究開發(fā)了一種高通量的篩選方法，使用活化底物2,4-二硝基苯基β-D-葡萄糖苷和無機磷酸鹽來鑒定GP活性，并使用它來篩選大型插入宏基因組文庫，通過該方法研究人員從CAZy家族GH3中鑒定了一個以前未知的β保留GP，該酶具有磷酸化纖維素和纖維寡糖的β-1,4糖苷鍵的能力[30]。除此之外，近年來利用酶的偶聯(lián)反應(yīng)合成β-糖苷也得到了廣泛的研究，例如使用無糖基化活性的蔗糖磷酸化酶將蔗糖分解為磷酸化葡萄糖和果糖，再通過纖維二糖磷酸化酶將磷酸化葡萄糖轉(zhuǎn)移至烷基醇，設(shè)計出一種以蔗糖為糖供體合成烷基β-糖苷的新方法[31]。這種酶偶聯(lián)反應(yīng)也被報道用于乳糖-N-二糖的千克規(guī)模制備[32]。

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase, GTs)是自然界大量天然糖苷的合成酶，例如萜類和黃酮類化合物等，具有來源廣泛、種類多樣、轉(zhuǎn)糖基活性較高、底物專一性和區(qū)域選擇性高等特點，這些酶需利用活化的二磷酸核苷糖化合物(UDP-Glu、UDP-Gal、GDP-Man等)作為糖基供體底物。研究顯示，在提供多個糖基化位點的受體反應(yīng)中，GT通常顯示出良好的區(qū)域位點選擇性。因此，GT亦被認(rèn)為是潛在的高活性糖基化催化劑，能夠在一步轉(zhuǎn)化中實現(xiàn)多種復(fù)雜化合物的β-糖苷的定點合成，如表3所示。

在GT合成β-糖苷的應(yīng)用方面，為了避免使用昂貴的活化糖基供體，近年來研究人員通過多酶聯(lián)用構(gòu)建代謝改造的工程化細(xì)胞工廠來合成活化的糖基供體，再通過高密度發(fā)酵在細(xì)胞內(nèi)對多種產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾[33-34]。以焦磷酸化酶的UDP-糖基供體的循環(huán)再生為例，在體內(nèi)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶可以催化1-磷酸葡萄糖和UTP合成UDP-G作為糖原合成的活化糖基供體。按照該方法，研究人員在體外構(gòu)建了UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的循環(huán)再生，并偶聯(lián)GT進(jìn)行化合物的糖基化，其反應(yīng)過程如圖3所示。PANDEY等[33]構(gòu)建了一個大腸桿菌細(xì)胞工廠，其中編碼UDP-木糖途徑葡萄糖變位酶(nfa44530)、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(galU)、UDP-葡萄糖脫氫酶(calS8)和UDP-葡萄糖醛酸脫羧酶(calS9)以及來自擬南芥的GT(arGt-3)的基因在大腸桿菌BL21(DE3)中過表達(dá)，用來生產(chǎn)槲皮素3-O-木糖苷，經(jīng)條件優(yōu)化后槲皮素糖苷的轉(zhuǎn)化率由54.75%提高到98%。吲哚酚是藍(lán)色染料靛藍(lán)一種高反應(yīng)性前體，通過異源表達(dá)靛藍(lán)植物Polygonumtinctorium來源的β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶PtUGT1對吲哚酚進(jìn)行β-葡萄糖基化，可形成穩(wěn)定且更易溶解的葡萄糖苷衍生物[35]。阿維菌素對多種線蟲和節(jié)肢動物寄生蟲具有良好的療效，但其水溶性較低，通過地衣芽孢桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶BLC對其進(jìn)行糖基化形成糖苷，實驗表明阿維菌素糖苷的水溶性提高了大約50倍，且抗線蟲活性提高大約30倍[36]。

表3 糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)與底物特異性Table 3 Enzymatic properties and substrate specificity of glycosyltransferase

圖3 糖基轉(zhuǎn)移酶參與的糖基化循環(huán)過程Fig.3 The glycosylation cycle of glycosyltransferase

3 β-糖基化酶的定向改造

GTs雖然是絕大多數(shù)天然化合物β-糖苷的生物合成酶，但因使用昂貴且穩(wěn)定性差的活化糖基供體，其應(yīng)用受到限制。近年來，因糖苷酶可利用簡單且廉價的底物對小分子化合物進(jìn)行β-糖基化修飾，其應(yīng)用潛力被不斷開發(fā)。但天然糖苷酶往往存在催化活性低或者區(qū)域選擇性差等問題，難以滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。為了克服天然酶存在的局限性，通過定向進(jìn)化方法可改善糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基特性，包括催化活性、熱穩(wěn)定性、底物選擇性和對有機試劑的耐受性等。

3.1 底物譜拓展

通常底物特異性的改變是一項困難的任務(wù)，因為酶在結(jié)合糖基供體和糖基受體的亞位點都表現(xiàn)出非常高的選擇性。盡管如此，通過酶工程調(diào)節(jié)，已有一些在改變糖基供體或者糖基受體選擇性上成功的案例，從而拓寬了β-葡萄糖苷酶的糖基供體底物。有研究發(fā)現(xiàn)Sulfolobussolfataricus的β-糖苷酶中的殘基W433和E432是糖苷供體底物特異性的決定因素，而突變體E432C和W433C可以消除其與糖底物的4位羥基和3位羥基的關(guān)鍵相互作用，從而降低了糖基供體底物識別的專一性特性，可識別葡萄糖、半乳糖和巖藻糖等糖基，因此產(chǎn)生了糖基供體底物拓寬的2種突變體糖苷酶[41]。植物來源的野生型β-葡萄糖苷酶對二糖和三糖具有活性，其突變體R342Y和R342A對四糖或五糖表現(xiàn)出較高的偏好[42]。

不同的β-糖基化酶對各種糖基受體具有不同的偏好。例如，β-半乳糖苷酶一般催化半乳糖和受體醇羥基之間O-糖苷鍵的形成，而酚羥基的糖基化報道較少。但LU等[43]通過對L.bulgaricusL3的β-半乳糖苷酶(BgaL3)進(jìn)行合理設(shè)計，增強了BgaL3對酚羥基的偏好，通過推測BgaL3的活性中心入口處的第980位色氨酸殘基(W980)在酶的糖基受體底物選擇中起關(guān)鍵作用。隨后對該位點進(jìn)行飽和突變產(chǎn)生了一個突變體W980F，該突變體對兒茶酚、對苯二酚和苯酚的糖基化活性從7.6%提高到53.1%。

3.2 提高轉(zhuǎn)糖基化效率

GH能同時催化水解和轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，所以催化反應(yīng)產(chǎn)物中往往包含水解產(chǎn)物。β-糖基化酶可通過突變親核催化殘基改變其對產(chǎn)物的水解活性，即減弱水解活性的同時保留轉(zhuǎn)糖基活性，盡管酶的水解活性難以完全消除，但對催化殘基外的定點突變也可以改善轉(zhuǎn)糖基活性。

有研究通過合理設(shè)計獲得了Thermusthermophilus的β-糖苷酶(Ttβ-gly, GH1 家族)的2個單一突變體 F401S 和 N282T，它們顯示出比野生型酶更高的轉(zhuǎn)糖基化/水解比[44]。在此基礎(chǔ)上，研究者又對Ttβ-gly進(jìn)行單點突變，得到了4個新的突變體，它們合成β-構(gòu)型寡糖的轉(zhuǎn)糖基活性從野生型酶36%的轉(zhuǎn)化率提高到了68%～90%[45]。也有研究團隊通過改造Thermotogamaritima的β-葡萄糖苷酶獲得了6個突變體，其中突變體N222F的糖基供體底物從纖維二糖變成了龍膽二糖，使用對硝基苯酚糖苷和己醇進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)時，生成己基-β-糖苷的產(chǎn)率達(dá)到了84.7%，且水解下降了57.4%[46]。LUNDEMO等[47]將Thermotoganeapolitana的GH1家族的β-葡萄糖苷酶第220 位殘基采用3個不同氨基酸進(jìn)行替換，突變體的轉(zhuǎn)糖基活性與水解活性的比率從0.33提高到1.45～2.27，通過調(diào)節(jié)pH，突變體的水解活性在pH為10時基本消失。這些研究結(jié)果表明，通過蛋白質(zhì)工程和催化條件優(yōu)化，可減弱水解活性且保持轉(zhuǎn)糖基化活性。

3.3 區(qū)域選擇性

酶促β-糖苷的區(qū)域選擇性取決于β-糖苷酶的來源，一些酶具有專一的區(qū)域選擇性，而有些酶的區(qū)域選擇性較為復(fù)雜。例如生物合成的寡糖通常由聚合度2～3甚至更高的低聚糖的混合物形成，根據(jù)酶的來源不同，其催化合成的糖苷鍵也有所不同，這對于寡糖的產(chǎn)物純化與鑒定造成了困難。通過酶工程進(jìn)行改造后，其糖苷鍵的連接和寡糖的聚合度更加專一，這對于生物合成特定的低聚寡糖的益生元具有重要意義。

針對BacilluscirculansATCC 31382來源的β-半乳糖苷酶BgaD-D中8個活性位點氨基酸殘基(Arg185、Asp481、Lys487、Tyr511、Trp570、Trp593、Glu601 和 Phe616)進(jìn)行突變分析(如圖4所示)，結(jié)果表明與野生型相比，突變體 D481N合成異乳糖的產(chǎn)量增加了2.3倍，證實D481位點的突變有利于具有β-(1→3)和β-(1→6)連接的GOS的合成[48]。DRONE等[49]根據(jù)WITHERS策略，突變了T.thermophilus的Tt-β-Gly糖苷酶。突變體以α-D-吡喃糖基氟物為糖基供體，產(chǎn)生半乳糖基和葡萄糖基β-(1→3)-糖苷產(chǎn)物的產(chǎn)率高達(dá)90%，而野生型酶催化的產(chǎn)物中還有存在數(shù)量較大的β-(1→6)連接的糖苷區(qū)域異構(gòu)體。GH116家族Thermoanaerobacterium的木聚糖酶突變體 E441G 和 E441S比野生型酶的轉(zhuǎn)糖苷活性明顯提高，且糖苷鍵的產(chǎn)生更偏好于β-(1→4)連接的糖苷鍵[50]。

圖4 β-半乳糖苷酶BgaD-D活性中心Fig.4 The actie center junction of β-galactosidase BgaD-D

4 總結(jié)

近些年來，合成β-糖苷的諸多方法中，通過酶促進(jìn)行β-異構(gòu)體選擇性糖基化的方法被廣泛關(guān)注。雖然與化學(xué)合成法相比，酶促法合成β-異構(gòu)體選擇性糖基化具有一定的優(yōu)勢，但也常常受限于較低的活性或昂貴的糖基供體底物，比如UDP-糖或纖維二糖。此外，酶促法合成β-糖苷的效率也往往低于酶促法合成α-糖苷。α-糖基化酶的活性相對較高，且來源廣泛，其糖基供體底物廉價易得，比如蔗糖、糊精、淀粉等。因此，未來還需要從多個方面對β-糖基化酶進(jìn)行研究：(1)篩選更多具有高β-轉(zhuǎn)糖基化活性的糖基轉(zhuǎn)移酶；(2)利用基因及蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造現(xiàn)有的具有糖基化活性的酶，比如使其可采用廉價原料作為糖基供體、提高轉(zhuǎn)糖基活性和區(qū)域選擇性等；(3)構(gòu)建活性糖基供體合成的高效細(xì)胞工廠平臺，從而使來源廣泛且功能多樣的糖基轉(zhuǎn)移酶用于更多小分子化合物的β-糖基化。