降解苯丙氨酸益生菌的篩選及其在酸奶發(fā)酵中的應(yīng)用

馬欣瑩，紀(jì)媛媛，劉奧，周煒，印伯星，劉同杰，公丕民，張?zhí)m威，易華西*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266000)2(揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州，225000)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)是一種由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因缺陷所致的常染色體遺傳病[1]，患者體內(nèi)PAH活性降低或缺乏后，導(dǎo)致血、腦中苯丙氨酸的積累，對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[2]。苯丙氨酸不能進(jìn)一步代謝為左旋多巴、甲狀腺素、多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素等，其中多巴胺、腎上腺素等與神經(jīng)精神障礙相關(guān)的認(rèn)知密切相關(guān)[3]。

目前治療苯丙酮尿癥廣泛使用的方法有3種，即飲食治療[4]、酶治療[5]和基因治療[6]。然而酶療法會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫介導(dǎo)的不良反應(yīng)和過敏反應(yīng)，基因治療雖然具有一次性治療的特點(diǎn)，但存在價(jià)格高昂和潛在的遺傳毒性。因此，低苯丙氨酸飲食目前正受到越來越多的關(guān)注[7]。多項(xiàng)研究表明，益生菌具有代謝苯丙氨酸、增強(qiáng)腸道屏障功能、促進(jìn)腸道菌群平衡等作用[8]，因此開發(fā)安全、高效的益生菌制劑及其產(chǎn)品來輔助治療苯丙酮尿癥具有重要意義。

苯丙氨酸作為一種必需氨基酸，是乳酸菌生長(zhǎng)所必須的氮源。乳酸菌能夠合成苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo nialyase, PAL)，可以將苯丙氨酸代謝成為無毒的反式肉桂酸。此外，苯丙氨酸還可通過苯乙酸途徑、苯丙酮酸途徑進(jìn)行降解[9]。ISABELLA等[10]構(gòu)建了具有高苯丙氨酸解氨酶活性的基因工程菌株并成功應(yīng)用于臨床。因此，益生菌有望在苯丙酮尿癥的預(yù)防和輔助治療中發(fā)揮重要作用。目前，低苯丙氨酸含量的益生元糖巨肽在疾病治療方面取得了進(jìn)展[11]，但針對(duì)治療或緩解苯丙酮尿癥的益生菌的研究報(bào)道不多。本研究篩選出具有苯丙氨酸降解能力的益生菌菌株，并對(duì)這些菌株的益生菌特性及其發(fā)酵乳中的應(yīng)用潛力進(jìn)行了探討，以期為開發(fā)針對(duì)苯丙酮尿癥的功能性微生態(tài)制劑或特醫(yī)食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本試驗(yàn)選取的31株乳酸菌，分離自發(fā)酵乳和干酪等傳統(tǒng)發(fā)酵食品和嬰兒糞便；對(duì)照菌株、鼠李糖乳桿菌LGG，均保存于中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院功能性乳制品與益生菌工程研究室；酸奶發(fā)酵劑YF-L907(保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌)，北京多愛特生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司

L-苯丙氨酸特異選擇培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，K2HPO42.0，檸檬酸氫二胺2.0，乙酸鈉5.0，MgSO40.2，MnSO40.04，吐溫80 1.0，L-苯丙氨酸0.5，pH值(5.7±0.2)(25 ℃)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)材料

L-苯丙氨酸、反式肉桂酸、全脂乳粉、白砂糖。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sartorius 普及型pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯普公司；Blue pard恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDZX-75KBS全自動(dòng)滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 降解苯丙氨酸益生菌的篩選

實(shí)驗(yàn)方法參考SU等[12]的方法略有修改?；罨蟮木暌韵嗤腛D600(0.600～0.750)取10 mL培養(yǎng)液，8 000 r/min，4 ℃離心5 min，菌體沉淀用Tris-HCl(pH 7.4)洗滌2次后重懸。反應(yīng)體系中依次加入苯丙氨酸(50 mmol/L)2.5 mL，菌懸液4 mL，吐溫-80(0.5 g/L)0.5 mL并混合均勻，以不加入菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37 ℃水浴保溫10 min，加入HCl溶液(6 mol/L)0.2 mL終止反應(yīng)，離心除去菌體后，測(cè)定上清液在280 nm下的吸光值。酶活性的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：U，酶活性，mU/mL；Mw，肉桂酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；，反應(yīng)體積，mL；t，反應(yīng)時(shí)間，min；ρ，生成的肉桂酸質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.1.2 以苯丙氨酸降解率為靶標(biāo)的篩選

將上述菌懸液接種于L-苯丙氨酸特異選擇培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h后離心(6 000 r/min，4 ℃，15 min)，取2.00 mL稀釋液使用茚三酮比色法測(cè)定培養(yǎng)基中苯丙氨酸含量，以不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，由接入菌株前后體系苯丙氨酸含量計(jì)算苯丙氨酸降解率。

1.3.2 降解苯丙氨酸益生菌生長(zhǎng)特性、胃腸耐受及黏附性能測(cè)定

以2%的接種量將活化后的菌株接種于MRS肉湯中，每2 h測(cè)定培養(yǎng)體系在600 nm下的吸光值和體系的pH值，繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。菌體活化后經(jīng)離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)操作后，用PBS(pH 7.4)緩沖液洗滌2次后懸浮。吸取菌懸液于人工胃液中[13](胃蛋白酶0.35%、NaC1 0.2%，pH為3.0，過濾除菌)消化2 h，使用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。吸取經(jīng)人工胃液消化的菌液到人工腸液中[14](NaCl 0.44%，胰蛋白酶0.2%，NaHCO32.2%，膽鹽1.2%，pH為8.0，過濾除菌)消化4 h。存活率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：N，消化一定時(shí)間后消化液中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0，消化0 h消化液中的活菌數(shù)，CFU/mL。

根據(jù)SHAHEEN[15]的實(shí)驗(yàn)方法略有修改。取3 mL上述菌懸液與1 mL三氯甲烷混合，將混合液渦旋30 s后室溫靜置30 min。菌株表面疏水性的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，初始菌懸液的OD600值；Ax，混合溶液中水相的OD600值。

根據(jù)丁詩(shī)瑤等[16]的實(shí)驗(yàn)方法略有修改。取菌液4 mL渦旋10 s后在室溫下靜置3 h，將0.1 mL上層懸浮液加入3.9 mL PBS(pH 7.4)，菌株自聚性的計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0，初始菌懸液的OD600值；A1，靜置后菌懸液的OD600值。

1.3.3 發(fā)酵乳的制備

全脂復(fù)原乳(全脂乳粉12%，白砂糖6%)60 ℃水浴30 min，均質(zhì)(65 ℃，20 MPa)后迅速分裝至錐形瓶中，105 ℃下高溫殺菌5 min后，迅速冰浴冷卻至42 ℃,接種發(fā)酵劑YF-L907(保加利亞桿菌：108CFU/mL，嗜熱鏈球菌：108CFU/mL)為對(duì)照，L.plantarumYZX21的接種量分別為0、1×106、1×107CFU/mL，42 ℃發(fā)酵至pH 4.5左右，置于4 ℃下冷藏24 h后熟。酸奶冷藏后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，貯藏期間于第1、4、7、10、13、16、19、22天測(cè)量相關(guān)理化指標(biāo)。

1.3.4 pH和滴定酸度測(cè)定

將發(fā)酵乳樣品置于室溫平衡一定時(shí)間，采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每2 h測(cè)定1次，至發(fā)酵終點(diǎn)(pH 4.5)。在冷藏期間每3 d測(cè)量1次pH值。滴定酸度測(cè)定參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》。

1.3.5 活菌數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

參照中國(guó)乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)范RHB 103—2004《酸牛乳感官質(zhì)量評(píng)鑒細(xì)則》，選取10名評(píng)價(jià)員從色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味、滋味5個(gè)方面對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.7 發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)和苯丙氨酸含量的測(cè)定

將發(fā)酵乳適當(dāng)稀釋后，用BCA試劑盒測(cè)定發(fā)酵乳中的蛋白質(zhì)濃度。氨基酸分析使用氨基酸分析儀測(cè)定，準(zhǔn)確稱取2.0 g發(fā)酵乳樣品，加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%磺基水楊酸，充分振蕩后，5 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液過0.22 μm的水相濾膜后裝入液相管備用。上樣量為10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism er8.02進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解苯丙氨酸益生菌的篩選

采用茚三酮比色法和分光光度法，以苯丙氨酸降解能力和苯丙氨酸解氨酶酶活性為指標(biāo)，菌株初篩結(jié)果見表1。

經(jīng)過初篩得到L.plantarumYZX21和動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)F1-7，2株菌株的苯丙氨酸降解率分別為12.43%和10.09%(表1)。L.plantarumYZX21的苯丙氨酸降解率最高，可能是由于苯丙氨酸作為乳酸菌生長(zhǎng)的必需氨基酸之一，通過苯丙氨酸解氨酶對(duì)苯丙氨酸進(jìn)行降解，這與HUANG等[9]發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸可以通過肉桂酸代謝途徑進(jìn)行降解的研究報(bào)道一致。進(jìn)一步測(cè)定了2株菌的苯丙氨酸解氨酶酶活性，結(jié)果顯示L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的苯丙氨酸解氨酶活性分別為28.62和24.23 mU/mL。這與苯丙氨酸降解率分析的結(jié)果一致，同時(shí)也說明不同菌株對(duì)苯丙氨酸的降解能力與苯丙氨酸解氨酶活性相關(guān)。

2.2 降解苯丙氨酸益生菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸特性測(cè)定

菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)其生產(chǎn)應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)。對(duì)L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

表1 菌株初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of strain screening

a-生長(zhǎng)曲線；b-產(chǎn)酸曲線圖1 生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性Fig.1 Growth characteristics and acid production characteristics

L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的生長(zhǎng)特性與產(chǎn)酸特性相似，培養(yǎng)2 h左右即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)18 h左右生長(zhǎng)、產(chǎn)酸趨于穩(wěn)定；在對(duì)數(shù)期間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的pH值逐漸下降；穩(wěn)定期時(shí)培養(yǎng)基的pH值為3.6，表明L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，具有研究與開發(fā)低苯丙氨酸發(fā)酵食品的潛力[17]。

2.3 降解苯丙氨酸益生菌的胃腸環(huán)境耐受和定植能力評(píng)價(jià)

益生菌能夠發(fā)揮作用的前提是以一定數(shù)量的活菌形式到達(dá)腸道，對(duì)胃液和腸液環(huán)境具有一定的耐受性。胃液的pH值一般為2～3，食物成分在胃中一般停留時(shí)間為2～4 h，同時(shí)人體腸液中膽鹽濃度一般在0.03～0.30 g/100 mL[18]。體外實(shí)驗(yàn)對(duì)L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的胃腸液耐受性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明(圖2-a)，雖然胃液和腸液對(duì)這2株菌的生存和增殖具有一定的抑制作用，但L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7均具有較強(qiáng)的抵抗胃酸和腸液的低pH值能力，其中L.plantarumYZX21在腸液中的存活率為76.91%，顯著高于B.animalisF1-7。

益生菌在腸道中的黏附是益生菌在腸道定植發(fā)揮益生作用的重要因素之一。通過疏水性和自聚性的測(cè)定評(píng)價(jià)了L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的腸道黏附能力。結(jié)果表明L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的疏水性無顯著差異，但在自聚性方面，L.plantarumYZX21顯著高于B.animalisF1-7(圖2-b)，這表明L.plantarumYZX21的黏附能力優(yōu)于B.animalisF1-7，后續(xù)選擇L.plantarumYZX21進(jìn)一步研究。

a-胃腸液耐受性；b-黏附能力圖2 胃腸液耐受性和定植能力Fig.2 Gastrointestinal tolerance and adhesion ability

2.4 L.plantarum YZX21對(duì)酸奶發(fā)酵和貯藏的影響

以市售發(fā)酵劑YF-L907(含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)生產(chǎn)的發(fā)酵乳為對(duì)照，研究了不同添加量L.plantarumYZX21(1×106和1×107CFU/mL)在酸奶發(fā)酵中的應(yīng)用潛力，結(jié)果如圖3所示。

a-發(fā)酵過程pH變化；b-發(fā)酵過程酸度變化；c-發(fā)酵過程活菌數(shù)變化；d-冷藏過程pH變化圖3 植物乳桿菌YZX21對(duì)酸奶發(fā)酵和冷藏過程中pH、酸度和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of L.plantarum YZX21 on pH, acidity and iable count during yogurt fermentation and storage at 4 ℃

與市售發(fā)酵劑YF-L907相比，接種L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳pH值和酸度變化均稍晚于對(duì)照組，但添加L.plantarumYZX21對(duì)酸奶的整體發(fā)酵進(jìn)程沒有影響。此外，從圖3-a，3-b可知，L.plantarumYZX21對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)酸貢獻(xiàn)不大，這與L.plantarumYZX21在MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸特性不一致，表明L.plantarumYZX21的產(chǎn)酸特性與發(fā)酵底物有關(guān)。此外，添加L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳活菌數(shù)量高于對(duì)照組，結(jié)合發(fā)酵過程中pH值和酸度變化結(jié)果(圖3-a，3-b)，推測(cè)L.plantarumYZX21與發(fā)酵劑菌株(嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌)具有一定的協(xié)同共生作用。L.plantarumYZX21對(duì)酸奶發(fā)酵的整體進(jìn)程沒有影響，表明其可以作為輔助發(fā)酵劑應(yīng)用于酸奶發(fā)酵。在冷藏期間，3組發(fā)酵乳的pH值緩慢降低，說明發(fā)酵乳樣品的后酸化進(jìn)程緩慢，L.plantarumYZX21的加入不會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳的后酸化，再次表明L.plantarumYZX21具有發(fā)酵乳輔助發(fā)酵菌株的應(yīng)用潛能。

2.5 L.plantarum YZX21對(duì)發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響

從色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味、滋味等方面研究了L.plantarumYZX21對(duì)發(fā)酵乳感官特性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.4 Sensory ealuation of fermented milk

接種L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳在口感和滋味這2個(gè)方面的評(píng)價(jià)結(jié)果優(yōu)于對(duì)照組，添加不同劑量的L.plantarumYZX21發(fā)酵乳口感得分分別為23.50和22.25，顯著高于商業(yè)發(fā)酵乳，在滋味上得分分別為22.00和20.50，高于商業(yè)發(fā)酵乳，但無顯著差異。這可能與L.plantarumYZX21代謝苯丙氨酸等芳香族氨基酸產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)，表明L.plantarumYZX21可以改善酸奶的感官特性。

2.6 L.plantarumYZX21對(duì)發(fā)酵乳苯丙氨酸含量的影響

研究比較了添加和未添加L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)和苯丙氨酸的含量變化。結(jié)果表明L.plantarumYZX21具有較強(qiáng)的乳蛋白和苯丙氨酸降解能力(表3)。

表3 發(fā)酵乳蛋白質(zhì)和苯丙氨酸含量的變化 單位：mg/mL

對(duì)照發(fā)酵乳樣品中苯丙氨酸的含量為1.159 3 mg/mL。相較于對(duì)照組發(fā)酵乳，接種不同劑量L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳苯丙氨酸含量分別下降了11.39%和13.10%，且呈現(xiàn)劑量依賴性，YANG等[19]對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆乳過程苯丙氨酸的含量變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆乳中的苯丙氨酸含量呈緩慢下降趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果類似，但對(duì)苯丙氨酸降解及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

以苯丙氨酸降解能力和苯丙氨酸解氨酶酶活性為篩選靶標(biāo)，篩選出高效降解苯丙氨酸的L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7，且2株菌的生長(zhǎng)特性與益生特性良好。將L.plantarumYZX21作為輔助發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵乳，L.plantarumYZX21對(duì)發(fā)酵和冷藏過程中的pH、酸度、活菌數(shù)均無負(fù)面影響，同時(shí)能夠有效降低發(fā)酵乳中苯丙氨酸含量。綜上所述，L.plantarumYZX21具有明顯的苯丙氨酸降解能力，有望作為輔助發(fā)酵劑應(yīng)用于酸奶發(fā)酵，為苯丙酮尿癥患者開發(fā)低苯丙氨酸的功能性發(fā)酵食品。