豆腐乳生產(chǎn)工藝中防褐變的研究

高智杰，蔡伊萍，陳凱莉，陳婷婷，林國(guó)榮

（莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100）

0 引言

腐乳中富含有機(jī)酸、醇、酯、大豆異黃酮、大豆多肽等風(fēng)味物質(zhì)，具有抗氧化、降低血壓、降低膽固醇、防癌抗突變、改善阿爾茲海默病等作用[1-2]。豆腐乳在瓶?jī)?nèi)后期發(fā)酵和貯藏過(guò)程中主要發(fā)生的美拉德褐變使色澤不斷加深，不僅影響了其外觀和貨架期，還會(huì)造成風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，特別是對(duì)豆類(lèi)食品優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的流失[3]。根據(jù)菌種類(lèi)型可將腐乳分為毛霉腐乳、根霉腐乳、細(xì)菌腐乳和無(wú)菌腐乳等[4]；目前，我國(guó)生產(chǎn)腐乳的菌種以毛霉菌為主，酵母菌、米曲霉、根霉等多種菌種混合發(fā)酵[5]。

褐變現(xiàn)象從本質(zhì)上可分為酶促褐變和非酶促褐變2 種，腐乳的褐變屬于酶促褐變中的羰氨反應(yīng)褐變又稱(chēng)美拉德反應(yīng)，主要發(fā)生在水果、蔬菜等食物中[6]。因?yàn)槊狗置诘膬翰璺友趸冈谟坞x氧存在下催化了各種酚類(lèi)氧化成醌，進(jìn)而聚合為黑色素所致，引起腐乳顏色從黃到褐逐步加深，但隔絕氧氣就可防止這些變化。葡萄糖氧化酶（GOD） 可起到除去鹵水中的氧氣，從而抑制褐變，而且葡萄糖氧化酶具有酶的專(zhuān)一性，不會(huì)與鹵水中的其他物質(zhì)反應(yīng)[7]。因此試驗(yàn)通過(guò)在后酵湯料中添加不同劑量的葡萄糖氧化酶和半胱氨酸，來(lái)確定適宜的抑制褐變所需的葡萄糖氧化酶和半胱氨酸的量。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行進(jìn)一步提升，以葡萄糖氧化酶和半胱氨酸適宜比例配制復(fù)合抗褐變劑，進(jìn)行對(duì)比篩選，研究最合適的抗褐變劑添加量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：老豆腐、食鹽；毛霉、米根霉、酵母、米曲霉等，沂源康源生物科技有限公司提供。

試劑：半胱氨酸，上海源葉生物科技有限公司提供；葡萄糖氧化酶（食品級(jí)），浙江一諾生物科技有限公司提供；福林- 酚試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、pH 值7.2 磷酸緩沖溶液、酪蛋白，酪氨酸等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

儀器：DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱；UV1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；pH計(jì)，梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；CT3 型質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)BROOKFIELD 公司產(chǎn)品。

1.2 工藝流程

原料→預(yù)處理→前期發(fā)酵→搓毛腌制→后期發(fā)酵。

原料選用市售的老豆腐，由于其硬度、成型性較佳，在后酵與貯存過(guò)程中不會(huì)由于蛋白質(zhì)降解過(guò)度造成腐乳坯體柔軟過(guò)度而坍塌[8]。發(fā)酵時(shí)的乳坯水分應(yīng)保持在70%左右，試驗(yàn)采用蒸煮的方法去除豆腐中多余水分后，將豆腐切成2 cm×2 cm 的乳坯，然后為乳坯接種不同的菌種，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，待2～3 d 后乳坯表面形成致密的毛霉層；將毛坯進(jìn)行搓毛腌制，1～2 d 后將毛坯裝罐，用10%的鹵水密封發(fā)酵。

1.3 豆腐乳中優(yōu)質(zhì)菌種的篩選

腐乳的生化指標(biāo)主要在后酵期間進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，后期發(fā)酵是腐乳特有風(fēng)味形成、蛋白質(zhì)降解的主要階段，對(duì)腐乳后酵過(guò)程中生化指標(biāo)的變化進(jìn)行分析，可得到單菌種、混菌發(fā)酵腐乳品質(zhì)的差別[9-10]。試驗(yàn)通過(guò)將毛霉、米根霉、米曲霉以單霉的形式發(fā)酵，并且以毛霉+米根霉、毛霉+酵母、毛霉+米曲霉的形式按1∶1 的配比進(jìn)行混合發(fā)酵，篩選出最適的菌種發(fā)酵形式。

1.4 低褐變豆腐乳的制備工藝

首先，將同一批次生產(chǎn)的的鹽坯腐乳裝入瓶中，產(chǎn)品的量為150 mL，裝罐后密封于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中后酵成熟。向豆腐乳腐乳體系中添加GOD 以0，0.01%，0.02%，0.03% （W/V） 的量至后酵湯料，研究GOD 對(duì)腐乳褐變的影響。其次，將豆腐乳腐乳體系中添加半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為0.10%，0.15%，0.20%，0.25% （W/V） 和復(fù)合抗褐變劑（GOD∶半胱氨酸為1∶9），研究其對(duì)腐乳褐變的影響。同時(shí)，制備正常生產(chǎn)條件下不添加抗褐變劑的豆腐乳，作為對(duì)照。

1.5 腐乳的抗褐變穩(wěn)定性的研究

將低褐變豆腐乳制備工藝的產(chǎn)品置于25 ℃恒溫條件下，每2 個(gè)月對(duì)腐乳的褐變程度指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，考查豆腐乳的抗褐變穩(wěn)定性。

1.6 項(xiàng)目測(cè)定

1.6.1 蛋白酶活性測(cè)定

采用福林- 酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力[11]。將1 g全豆腐乳毛坯料中的酶，在溫度40 ℃、pH 值7.2 條件下，1 min 水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，定義為1 個(gè)酶活力單位。

1.6.2 褐變程度的測(cè)定

把腐乳湯汁過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取2 mL 濾后樣品用蒸餾水稀釋3 倍，以轉(zhuǎn)速4 300 r/min 離心15 min，取上清液用濾紙過(guò)濾得到澄清透明液體。以蒸餾水作空白，于波長(zhǎng)A420測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐乳中優(yōu)質(zhì)菌種的篩選

各菌種蛋白酶活力的比較見(jiàn)表1。

表1 各菌種蛋白酶活力的比較/U·g-1

由表1 可知，對(duì)比不同樣品的蛋白酶活性，可以發(fā)現(xiàn)相較于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵腐乳的蛋白酶活性更高，其中又以毛霉與根霉的菌種混合發(fā)酵效果更佳。蛋白酶活性越高，越有利于蛋白質(zhì)的水解，而腐乳作為大豆制品，其自身含有40%的蛋白質(zhì)，是人體所需蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。有研究表明，通過(guò)微生物發(fā)酵法水解蛋白生成肽的同時(shí)，部分苦味基團(tuán)會(huì)得到排列重組，使得大豆肽的溶解性變得更好，而且沒(méi)有異味和苦味。同時(shí)，毛霉不僅為腐乳提供包裹作用，還為后酵微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)催化大豆蛋白的深度降解[12-13]。李順等人[14]的研究表明，相較于單菌發(fā)酵，混合發(fā)酵在一定程度上不僅能彌補(bǔ)單菌發(fā)酵的某些不足，而且可以發(fā)揮單菌發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)。因此，可以理解為混菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵更全面，而混菌發(fā)酵中又以毛霉和根霉的組合效果更佳。因此，在菌種篩選的試驗(yàn)中，結(jié)果以毛霉與根霉按1∶1 的配比混合接種，進(jìn)行后續(xù)操作。

2.2 豆腐乳抗褐變的研究

2.2.1 GOD 添加量對(duì)豆腐乳褐變的影響

GOD 添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響見(jiàn)表2。

表2 GOD 添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響 / %

由表2 可知，沒(méi)有添加GOD 的腐乳褐變程度最深，后酵成熟豆腐乳的A420值均隨著GOD 添加量的增大而逐漸降低，這與還原糖消耗量的變化趨勢(shì)具有一致性；但當(dāng)添加量增大到0.02%及以上時(shí)，褐變程度降低幅度不大，因此繼續(xù)增加其用量對(duì)抑制腐乳體系褐變的意義不大，GOD 添加量以0.02%為宜。

2.2.2 半胱氨酸添加量對(duì)豆腐乳褐變的影響

半胱氨酸添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響見(jiàn)表3。

表3 半胱氨酸添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響

由表3 可知，未添加半胱氨酸的腐乳褐變程度最深；豆腐乳的A420值均隨著半胱氨酸添加量的增大而逐漸增加，在半胱氨酸添加量為0.10%時(shí)腐乳湯汁色澤最淺，腐乳的褐變程度最小。因此，半胱氨酸適宜添加量0.10%。

2.2.3 復(fù)合抗褐變劑添加量對(duì)豆腐乳褐變的影響

復(fù)合抗褐變劑添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響見(jiàn)表4。

表4 復(fù)合抗褐變劑添加量對(duì)米醬豆腐乳褐變的影響

由表2 ～表4 可知，添加0.01%GOD 酶豆腐乳的A420值為0.483，添加0.01%半胱氨酸豆腐乳的A420值為0.403；在復(fù)合抗褐變劑為0.10%的添加量下，A420值為0.352，腐乳湯汁色澤最淺，褐變程度最小，復(fù)合抗褐變劑對(duì)豆腐乳褐變比單一效果要好。但復(fù)合抗褐變劑處理的豆腐乳體系的A420值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。因此，復(fù)合抗褐變劑適宜添加量為0.10%。

2.4 低褐變豆腐乳在貯藏過(guò)程中的抗褐變穩(wěn)定性

低褐變米醬豆腐乳在貯藏期內(nèi)的抗褐變穩(wěn)定性見(jiàn)表5。

表5 低褐變米醬豆腐乳在貯藏期內(nèi)的抗褐變穩(wěn)定性

由表5 可知，當(dāng)恒溫貯藏10 個(gè)月后，傳統(tǒng)豆腐乳的A420值為1.762，表現(xiàn)為褐變程度極高的醬色，而低褐變腐乳的A420值只為0.732，褐變程度比傳統(tǒng)豆腐乳貯藏4 個(gè)月時(shí)A420值0.843 還低了15.2%，仍然顯示較淺色澤，表現(xiàn)出很好的抗褐變能力。在10 個(gè)月貯藏期間，豆腐乳湯汁的褐變程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，褐變不斷加深，低褐變豆腐乳體系的吸光值在整個(gè)貯藏期內(nèi)低于傳統(tǒng)豆腐乳產(chǎn)品。褐變度貯藏10 個(gè)月與傳統(tǒng)米醬豆腐乳貯藏3 個(gè)月相當(dāng)。因此，低褐變豆腐乳在保存中顯示很好的抗褐變穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

腐乳發(fā)酵時(shí)，采用混合菌種發(fā)酵（毛霉與根霉按1∶1 的配比） 相較于單個(gè)菌種發(fā)酵更有利于腐乳的品質(zhì)和口感，也有利于將豆腐所含有的蛋白質(zhì)水解為多肽和各種氨基酸，促使腐乳形成特有風(fēng)味。而在腐乳的后酵和貯藏期間發(fā)生的美拉德褐變，通過(guò)添加抗褐變劑能夠起到有效的抑制作用，單一添加0.02%的葡萄糖氧化酶和單一添加0.10%半胱氨酸都可以起到對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程中抑制褐變的效果，而復(fù)合抗褐變劑適宜添加量為0.10%比單一效果更好。適量添加復(fù)合抗褐變劑的腐乳的色澤和滋氣味等指標(biāo)都得到了一定的提高，且在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中仍顯示出優(yōu)異的抗褐變穩(wěn)定性。