細(xì)胞焦亡介導(dǎo)呼吸系統(tǒng)感染性疾病的研究進(jìn)展

楊治安 何瑤 劉維英 余勤

在我們過往熟知的細(xì)胞死亡方式中，根據(jù)死亡細(xì)胞的形態(tài)特征、死亡原因以及是否受機(jī)體調(diào)控，將死亡方式分為細(xì)胞自噬、細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡以及細(xì)胞鐵死亡等。近年來，細(xì)胞焦亡成為研究的熱點(diǎn)，它是一種新的與炎性反應(yīng)相伴隨的程序性壞死樣細(xì)胞死亡方式，在清除外源性病原體感染和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號損傷中發(fā)揮重要作用，但由于它無法準(zhǔn)確識別“自己”與“異己”成分，所以焦亡也會破壞正常細(xì)胞，造成機(jī)體部分功能障礙。細(xì)胞焦亡在呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，本文就細(xì)胞焦亡介導(dǎo)幾種主要的呼吸系統(tǒng)感染性疾病的研究現(xiàn)狀做如下綜述。

1 細(xì)胞焦亡概述

1.1 細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)歷程：關(guān)于細(xì)胞焦亡的最早認(rèn)識，可以追溯到1986年，F(xiàn)riedlander[1]發(fā)現(xiàn)用炭疽致命毒素處理小鼠巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物快速外釋引起細(xì)胞死亡。之后很長時間由于受限于當(dāng)時實(shí)驗(yàn)條件而未能準(zhǔn)確描述記錄其特征，以至于被錯誤歸類為細(xì)胞凋亡[2]。1999年發(fā)現(xiàn)了Caspase-1依賴性細(xì)胞死亡[3]，為日后奠定Caspase-1在焦亡中的核心地位提供了重要遺傳證據(jù)。直至2001年Cooksen等[4]提出了pyroptosis一詞，將這種依賴Caspase-1的特殊的快速死亡方式，命名為細(xì)胞焦亡。2002年，Martinon等[5]提出炎性小體作為Caspase-1活化平臺，能夠調(diào)節(jié)Caspase-1的活化。后期隨著gasdermin蛋白家族的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡途徑變得相對完整。

1.2 細(xì)胞焦亡的特征與功能 由于炎性反應(yīng)的出現(xiàn)和Caspase-1的活化，細(xì)胞焦亡被當(dāng)作一種非典型性細(xì)胞死亡方式，同時具備細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死的部分相關(guān)特征[6]。焦亡的免疫防御功能主要是通過破壞病原體復(fù)制點(diǎn)位以及通過胞膜成孔特性進(jìn)而裂解細(xì)胞直接殺死胞內(nèi)細(xì)菌來實(shí)現(xiàn)[7]。見表1。

表1 細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死的異同點(diǎn)

1.3 細(xì)胞焦亡的通路蛋白

1.3.1 模式識別受體與NLRP3：炎癥小體固有免疫系統(tǒng)感受外來病原體侵襲及機(jī)體內(nèi)部損傷分子主要依靠模式識別受體(pattern-recognition receptor,PRR)來完成[8]。根據(jù)PRR的亞細(xì)胞定位不同，可將其分為胞膜上受體和胞質(zhì)內(nèi)受體2組，筆者發(fā)現(xiàn)NLR受體(NOD-like receptor)是目前研究較為廣泛的胞質(zhì)內(nèi)受體，該蛋白家族中目前研究最多的當(dāng)屬NLRP3。在細(xì)胞焦亡中，NLRP3通過PYD結(jié)構(gòu)域與接頭分子含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)通過同型相互作用而結(jié)合，繼而結(jié)合Caspase-1前體，即pro-Caspase-1，激活Caspase-1[9]。我們將NLRP3-ASC-pro-Caspase-1復(fù)合體稱之為NLRP3炎癥小體。

1.3.2 Caspase蛋白酶Caspase-1和 Caspase-4/5/11：Caspase蛋白酶全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，它是一組以酶原形式存在于胞質(zhì)中的具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白酶家族，在細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮重要作用。目前，在哺乳動物細(xì)胞中被鑒定出的caspase家族成員有16 種，人類細(xì)胞中被鑒定出的有11種，其中Caspase-1是該家族中第1個被證實(shí)具有將pro-IL-1β、pro-IL-18分別激活為IL-1β、IL-18特性的成員，因此Caspase-1也被稱之為interkeukin 1b conberting enzyme(ICE)，即白介素轉(zhuǎn)化酶[10]，參與細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑；Caspase-3被證實(shí)與細(xì)胞凋亡相關(guān)；Caspase-4/5/11則參與細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑。

1.3.3 gasdermin蛋白家族：人類gasdermin蛋白家族包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME以及DFNB59六種，其中GSDMD又稱為消皮素D，是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑的共同效應(yīng)分子[11]，是細(xì)胞焦亡的直接執(zhí)行者，通過寡聚化在細(xì)胞膜上打孔，故也將其形象稱之為“打孔蛋白”。GSDMA、B、C、E都具有類似于GSDMD的成孔特性，而DFNB59還未被證實(shí)。研究還發(fā)現(xiàn)，GSDMB在人類的多態(tài)性與幼兒早期哮喘關(guān)系密切[12]，DFNB59的遺傳突變會導(dǎo)致人類的非綜合征性聽力喪失[13]。

1.4 細(xì)胞焦亡的信號通路 人和小鼠體內(nèi)的細(xì)胞，在發(fā)生焦亡時，根據(jù)所依賴的Caspase種類不同，可以將焦亡途徑分為以下兩類：經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)或者危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular pattern,DAMP)作為初始刺激物，刺激啟動經(jīng)典途徑；脂多糖(LPS)作為初始刺激物，啟動非經(jīng)典途徑。見圖1。

圖1 肺組織巨噬細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑信號傳導(dǎo)模式圖

2 細(xì)胞焦亡與呼吸系統(tǒng)感染性疾病的關(guān)系

細(xì)胞焦亡過程必須在機(jī)體嚴(yán)密精細(xì)的調(diào)控之下進(jìn)行，一旦調(diào)節(jié)失衡，會導(dǎo)致組織損傷和破壞，亦或機(jī)體代謝紊亂、功能缺失與亢進(jìn)等。肺臟是一種特殊的器官，擁有敏感的氣道上皮-血管內(nèi)皮細(xì)胞交界面，以便在暴露于病原體和氣溶膠毒素等應(yīng)激源中時，依舊能夠進(jìn)行通暢且高效的氣體交換。

2.1 細(xì)菌性肺炎與病毒性肺炎 在細(xì)菌性肺炎中，當(dāng)革蘭陰性菌侵入肺組織細(xì)胞后，受到其胞壁成分脂多糖(LPS)或胞質(zhì)內(nèi)脂多糖的刺激，細(xì)胞焦亡非經(jīng)典途徑被激活，人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11作為胞內(nèi)受體[14-16]，通過CARD結(jié)構(gòu)域直接識別LPS，然后寡聚形成的多蛋白復(fù)合物，直接激活GSDMD，介導(dǎo)焦亡進(jìn)程，所以caspase-4/5/11在非經(jīng)典途徑中同時扮演了PRR和焦亡誘導(dǎo)劑的角色；當(dāng)然在此過程中也可以間接激活caspase-1，進(jìn)入焦亡經(jīng)典途徑，實(shí)現(xiàn)兩條途徑的融合；革蘭氏陽性菌則通過誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體形成，激活更為常見的焦亡經(jīng)典途徑引起肺組織炎性反應(yīng)，信號傳導(dǎo)通路如圖1所示。對于病毒性肺炎，有研究證實(shí)甲型流感病毒通過識別呼吸道上皮細(xì)胞的維甲酸誘導(dǎo)基因-I(RIG-I)受體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡，引起炎性反應(yīng)[17]。2003年SARS冠狀病毒(SARS-CoV)與2019年新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸綜合征，通過大量的臨床取樣研究，發(fā)現(xiàn)患者血清中IL-1β、乳酸脫氫酶(LDH)等促炎因子含量明顯增加[18]，進(jìn)而招募白細(xì)胞、單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞聚集，可顯著加重肺炎癥狀，包括嚴(yán)重的呼吸窘迫和發(fā)熱，我們將其稱之為細(xì)胞因子風(fēng)暴，也稱為細(xì)胞因子釋放綜合征，與疾病的加重有關(guān)[19]。SARS-CoV至少表達(dá)3種激活NLRP3炎癥小體的蛋白質(zhì)：胞膜、ORF3a和ORF8b，通過改變胞內(nèi)外離子濃度、線粒體損傷、ROS生成增加等機(jī)制激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生[20]。鑒于SARS-CoV-2與SARS-CoV的遺傳相似性約79%， SARS-CoV-2也可同樣激活NLRP3炎癥體；此外SARS-CoV-2病原體相關(guān)的分子模式也可被RNA感知模式識別受體識別，包括TLR3、TLR7、TLR8以及位于細(xì)胞質(zhì)中的RIG-I[21]。由于吞噬病毒的巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡導(dǎo)致細(xì)胞破裂釋放大量的胞內(nèi)容物，包括病毒顆粒、細(xì)胞因子、趨化因子、LDH、ATP和ROS等，促使周圍免疫細(xì)胞接力這種炎性反應(yīng)，從而誘導(dǎo)焦亡鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，我們也將此稱之為細(xì)胞焦亡的“級聯(lián)放大效應(yīng)”，因此廣泛的焦亡可能在短時間內(nèi)引起組織過度損傷、器官衰竭、甚至是機(jī)體的死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，在COVID-19肺炎患者中，由于焦亡誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，還可以出現(xiàn)凝血功能異常[22]、川崎病[23]等并發(fā)癥。治療方面，無論是細(xì)菌性肺炎，還是病毒性肺炎，用NLRP3抑制劑可以顯著降低此類并發(fā)癥的發(fā)病率，而通過抑制NLRP3的另一個潛在好處是可以改善肺炎患者的共患病病情，以慢性疾病常見，包括高血壓、慢性阻塞性肺疾病、2型糖尿病和心血管疾病等，新冠肺炎患者病死率在老年人群體中較高，所以運(yùn)用NLRP3抑制劑可以有效降低重癥肺炎患者或肺炎合并多種慢性基礎(chǔ)疾病患者構(gòu)成比，同時降低病死率; 也有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NLRP6以增加中性粒細(xì)胞相關(guān)的細(xì)菌清除應(yīng)被視為治療金黃色葡萄球菌肺炎的潛在治療干預(yù)策略[24]；在不破壞炎癥小體激活的情況下阻止GSDMD孔形成也是一種很有前途的治療切入點(diǎn)，因?yàn)槿藗兛梢酝ㄟ^引起炎癥性細(xì)胞凋亡死亡而不是焦亡來限制細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制和擴(kuò)散，從而限制廣泛的組織炎癥播散。

2.2 慢性阻塞性肺病(COPD)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，支氣管上皮細(xì)胞株，暴露在煙霧刺激中，可以出現(xiàn)caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[25]。Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常小鼠，NLRP3基因敲除小鼠對于煙霧刺激的耐受性更高，同時肺功能下降也不明顯?？晌腩w粒(particulate matter)也是COPD的致病因素之一，其暴露于氣道會誘導(dǎo)上皮細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化。Li等[27]發(fā)現(xiàn)NLRP3/caspase-1信號通路在PM2.5顆粒誘導(dǎo)的肺損傷和肺部炎癥中是必需的，而通過caspase-1抑制劑(Z-YVAD-FMK)干預(yù)可以顯著減輕肺損傷，此發(fā)現(xiàn)可能為今后顆粒物呼吸毒性的研究提供思路。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者氣道中的炎性小體激活物，包括ROS、細(xì)胞外ATP和其他DAMP有所增加[28]，而在肺泡灌洗液、血液或者痰液中，IL-1β、IL-18等細(xì)胞焦亡的下游因子明顯增加[29]。IL-1β是炎癥放大的啟動因子，能募集、激活其他免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子(如IL-18)、炎性因子(如IL-6)、黏附分子等的合成，F(xiàn)u等[30]發(fā)現(xiàn)COPD患者氣道中IL-1β的表達(dá)水平和全身炎癥范圍、急性加重頻率存在相關(guān)性，提示IL-1β可作為該病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子指導(dǎo)臨床。肺組織中的IL-18高表達(dá)會引起肺氣腫，而IL-18含量會隨著COPD病情加重而增加，所以血清中IL-18含量與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，基于此我們可以通過檢測血清中IL-18含量來作為COPD穩(wěn)定期病情嚴(yán)重程度評估的指標(biāo)[31]。Udjus等[32]研究表明，Caspase-1 通路的激活可以導(dǎo)致肺血管平滑肌增殖，引起肺動脈高壓。綜上，細(xì)胞焦亡在COPD氣道上皮損傷和肺氣腫的形成過程中發(fā)揮了重要作用，而且炎性因子的長期釋放與氣道慢性長期損傷存在緊密的聯(lián)系，當(dāng)然也為臨床COPD患者管理提供了診斷、治療、監(jiān)測的新靶點(diǎn)。

2.3 支氣管哮喘 氣道上皮完整性的喪失是哮喘發(fā)病機(jī)制的重要標(biāo)志，細(xì)胞死亡作為氣道上皮完整性缺失的機(jī)制之一，得到了大家的廣泛關(guān)注。無論是在輔助性T淋巴細(xì)胞2(Th2)相關(guān)性哮喘還是非Th2相關(guān)性哮喘，無論是體外過敏原攜帶的PAMP，亦或者是機(jī)體內(nèi)部致敏小分子攜帶的DAMP，NLRP3炎癥小體均可被激活，如前文所述GSDMB與哮喘關(guān)系密切，GSDMB蛋白被Caspase-1切割，釋放其N末端片段，在細(xì)胞膜上形成空洞，誘發(fā)細(xì)胞焦亡。Tsai等[33]研究發(fā)現(xiàn)，粉塵螨變應(yīng)原Der F1可以誘導(dǎo)以Caspase-1活化和IL-1β分泌為特征的炎癥體形成，通過焦亡經(jīng)典途徑引起上皮細(xì)胞死亡，破壞氣道上皮完整性。動物實(shí)驗(yàn)表明，哮喘小鼠體內(nèi)NLRP3炎癥小體和Caspase-1蛋白表達(dá)增加，下游炎性因子，諸如IL-1β、TNF-α明顯增加[34]。疾病治療方面研究發(fā)現(xiàn)，利用Caspase-1抑制劑預(yù)處理上皮細(xì)胞，或者通過Si-RNA轉(zhuǎn)染沉默NLRP3，可以減少IL-1β等促炎因子的釋放，或者剪接變異體rs11078928通過刪除編碼GSDMB N末端13個氨基酸的外顯子6，從而使GSDMB喪失誘發(fā)焦亡的能力[35]，以達(dá)到治療的目的。目前臨床中，運(yùn)用糖皮質(zhì)激素只能起到緩解哮喘患者癥狀的作用，同時還面臨部分患者糖皮質(zhì)激素耐受、甚至抵抗的嚴(yán)峻形勢下，在此背景下尋找一新的治療靶點(diǎn)意義深遠(yuǎn)。前列腺素E2(PGE2)常表現(xiàn)出多種促炎活性被大家所熟知，但矛盾的是，PGE2亦通過抑制干擾素-β(IFN-β)的產(chǎn)生，減弱STAT-1的磷酸化，抑制焦亡進(jìn)程，有助于炎癥的控制和消退，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而對哮喘和過敏性氣道炎癥起到一定的保護(hù)作用[36]。

2.4 急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)/急性肺損傷(ALI) ARDS/ALI是一種頑固性、進(jìn)行性低氧性呼吸衰竭，以急性彌漫性肺泡損傷、中性粒細(xì)胞大量涌入和肺泡腔富含蛋白質(zhì)的滲出物為特征，因高死亡率備受關(guān)注，而無節(jié)制的肺部炎癥可能是高死亡率的原因。既往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，LPS暴露下的肺組織，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞大量浸潤，Caspase-1裂解增加，IL-1β分泌活躍[37]；而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論，LPS處理巨噬細(xì)胞后，NLRP3和Caspase-1表達(dá)明顯上調(diào)[37]。因此，各種病因不僅通過增加巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集引起過度的肺部炎癥，還可以通過巨噬細(xì)胞的焦亡引起促炎性因子的大量釋放，所以推測細(xì)胞焦亡可能是ARDS/ALI肺部過度炎癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。P38-MAPK信號通路可能參與ARDS/ALI的炎性反應(yīng)[38]，炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生，包括IL-1β、TNF-α、IL-6等，都是通過P38-MAPK信號通路，這也為炎性反應(yīng)的調(diào)控提供了作用靶點(diǎn)。當(dāng)阻斷肺泡巨噬細(xì)胞中P38-MAPK信號通路時，NLRP3的表達(dá)、Caspase-1的裂解明顯減低，IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)也減少，而凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、Caspase-3的裂解則出現(xiàn)明顯增加，這一現(xiàn)象提示阻斷P38-MAPK信號通路可能促使巨噬細(xì)胞死亡方式由焦亡向凋亡的轉(zhuǎn)變，細(xì)胞凋亡可以阻斷促炎介質(zhì)、蛋白酶、活性氧的產(chǎn)生和溶菌酶的滲漏，進(jìn)而保證機(jī)體擁有一定限度的損傷耐受性[39,40]，所以細(xì)胞死亡方式的這一轉(zhuǎn)變可能是為通過阻斷P38-MAPK信號通路而控制ARDS/ALI肺部炎癥提供了治療的理論依據(jù)。

作為機(jī)體天然免疫的重要組成部分，焦亡在有效清除病原體入侵及體內(nèi)危險(xiǎn)分子損害方面發(fā)揮重要作用，但是由于其級聯(lián)放大的炎性反應(yīng)特征，IL-1β、IL-18等不同程度地參與了呼吸系統(tǒng)感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，也可以將細(xì)胞焦亡的過程稱之為炎癥發(fā)生的過程，焦亡的程度在一定意義上反映了炎癥的嚴(yán)重程度，二者相互關(guān)聯(lián)。在未來的實(shí)驗(yàn)室研究以及臨床應(yīng)用中，能否運(yùn)用焦亡通路上下游各種信號分子作為疾病預(yù)防、病情監(jiān)測、危險(xiǎn)度分級、用藥評估、預(yù)后轉(zhuǎn)歸的參考依據(jù)，諸如通過化學(xué)法檢測血清中活性氧(ROS)成分含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量等來反應(yīng)肺組織抗氧化能力，對疾病發(fā)展進(jìn)行一定范圍內(nèi)的預(yù)判；以及上文提到過的通過檢測炎性因子含量，對肺部感染輕重程度、全身炎癥范圍、急性加重頻率進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測等。同時，相關(guān)研究也提出，GSDMD對于凋亡相關(guān)Caspase的敏感性較低，而將GSDMD位于C端與N端之間的區(qū)域進(jìn)行剪切編輯以增加對凋亡通路相關(guān)蛋白的敏感性，這樣就可以進(jìn)行凋亡過程的誘導(dǎo)，而后，人們又發(fā)現(xiàn)凋亡通路的關(guān)鍵蛋白caspase-3亦可以影響和激活GSDME，從而導(dǎo)致焦亡[41]，至此實(shí)現(xiàn)了凋亡與焦亡兩種不同細(xì)胞結(jié)局的雙向切換，從而抑制機(jī)體大范圍的炎性反應(yīng)，成為疾病治療一個新的切入點(diǎn)，這些值得我們?nèi)ミM(jìn)一步地思考和研究。

近年來，針對于細(xì)胞焦亡通路的靶向藥物研究也越來越多，特異性的NLRP3抑制劑、caspase-1抑制劑、IL-1抑制劑相對于傳統(tǒng)廣譜抗炎藥物，具有精準(zhǔn)度高、安全性高的特點(diǎn)，但是目前真正應(yīng)用于臨床的還比較少，所以希望未來越來越多此方面的藥物研究，能夠?yàn)榛颊邘砀嗟闹委熯x擇。