強直性脊柱炎患者血清IL-35、IL-17的臨床意義

王月明 田軍艷

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者是一種慢性炎癥性自身免疫性病癥，以外周大關(guān)節(jié)、椎旁軟組織、軸骨關(guān)節(jié)等為主要病變部位，疾病進展可出現(xiàn)關(guān)節(jié)強直、脊柱畸形[1，2]?，F(xiàn)階段，我國AS患者約有400多萬，這一病癥具備的慢性進展性、致殘性等特點不僅會給患者帶來巨大的痛苦，還會造成社會重大經(jīng)濟損失[2]。目前，AS發(fā)生機制尚未完全明確，主要與免疫、環(huán)境、遺傳等因素相互作用有關(guān)，且遺傳危險因素主要有TBX21、IL-27、PTGER4、NKX2-1、IL-12B、IL-7R、IL-6R、IL-1R2、IL-1R1等，這些因素多與經(jīng)固有與適應性免疫效應細胞介導的白介素-17(IL-17)免疫有關(guān)。一部分研究顯示，AS發(fā)生多與免疫功能異常有關(guān)，特別是CD4+T細胞亞群，AS發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)/輔助性T細胞17(Th17)細胞亞群比例失調(diào)發(fā)揮著重要作用[3，4]。IL-17作為一種特異性細胞因子，多由Th17細胞分泌，可對白細胞活化、遷移產(chǎn)生促進作用，其在腫瘤、自身免疫性病癥發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。IL-35作為一種抑制性細胞因子，是IL-12家族中最新發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，其與IL-12家族細胞因子的結(jié)構(gòu)特點相同，經(jīng)IL-27β鏈Ebi3、IL-12α鏈p35組合而成，多由Treg分泌，其可對IL-17分泌、Th17細胞分化產(chǎn)生抑制，并促使Treg細胞增殖，進而參與集體免疫調(diào)節(jié)[6]。部分研究顯示，變應性鼻炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及炎癥性腸病等免疫介導性病癥發(fā)生發(fā)展中IL-35有著重要作用[7-9]。本研究以AS患者為研究對象，分析血清IL-17、IL-35水平檢測對AS患者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用回顧性分析方法，以2020年1月至2021年1月入院的62例AS患者為研究對象，設(shè)為研究組；以同期入院進行體檢的62例健康者為對照組。研究組中，男53例，女9例；年齡15～49歲，平均(32.06±7.82)歲。對照組中，男50例，女12例；年齡16～50歲，平均(32.39±7.94)歲。所有研究對象對本研究知情并簽署同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，倫理標號202001018。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合美國風濕病協(xié)會制定的AS診斷標準[10]；②無生物制劑、抗風濕藥及激素等治療；③資料完整。

1.2.2 排除標準：①哺乳期或妊娠期女性；②急慢性感染；③伴血液系統(tǒng)病癥；④伴其他免疫相關(guān)性病癥；⑤伴精神病癥。

1.3 方法

1.3.1 檢驗試劑、儀器：①試劑：Hs-CRP試劑盒(德國羅氏公司)、ELISA試劑盒(eBioscience公司)、HLA-B27試劑盒(BD公司)。②儀器：羅氏702全自動生化儀(德國羅氏公司)、Well Scan K3酶標儀(芬蘭雷勃公司)、SYM-BIO2510 酶標板振蕩器(上海新波生物技術(shù)有限公司)、SYM-BIO EGATA2310 全自動洗板機(上海新波生物技術(shù)有限公司)、流式細胞儀 FACSCantoTM Ⅱ(美國BD公司)。

1.3.2 血清hs-CRP、ESR：2組均于清晨空腹時采集2 ml肘靜脈血，予以枸櫞酸鈉抗凝，紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)選取魏氏法測定。同時，2組均于清晨空腹時采集5 mL肘靜脈血，于無抗凝劑的真空采血管內(nèi)置入，離心半徑、轉(zhuǎn)速分別為15 cm、3 000 r/min，離心15 min后分離血清，hs-CRP選取散射比濁法測定。

1.3.3 血清IL-17、IL-35測定：2組均于清晨空腹時采集5 ml肘靜脈血，離心半徑、轉(zhuǎn)速分別為15 cm、3 000 r/min，離心15 min后分離血清，血清IL-17、IL-35選取酶聯(lián)免疫吸附法測定。

1.4 觀察指標 觀察2組患者血清hs-CRP、ESR、IL-17及IL-35水平，并選取Pearson 相關(guān)分析法分析AS患者血清IL-17、IL-35水平與Bath AS 疾病活動指數(shù)評分表(BASDAI)評分、hs-CRP、ESR水平之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 2組血清炎性活動指標ESR、Hs-CRP水平比較 研究組血清Hs-CRP、ESR水平較對照組更高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清炎性活動指標ESR、Hs-CRP水平比較

2.2 2組血清IL-17、IL-35水平比較 研究組較對照組血清IL-17水平更高，IL-35水平更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清IL-17、IL-35水平比較

2.3 AS患者血清IL-17、IL-35與BASDAI評分、hs-CRP、ESR相關(guān)性分析 AS患者血清IL-35水平與BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈負相關(guān)(P<0.01)；血清IL-17水平與BASDAI評分、Hs-CRP、ESR水平呈負相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表3 AS患者血清IL-17、IL-35與BASDAI評分、hs-CRP、ESR相關(guān)性分析

2.4 AS患者血清IL-17與IL-35相關(guān)性分析 AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關(guān)(r=-0.352，P<0.01)。見表4。

表4 AS患者血清IL-17與IL-35相關(guān)性分析

3 討論

AS是一種慢性炎癥性自身免疫性病癥，一旦發(fā)病極易導致患者殘疾，誘發(fā)關(guān)節(jié)功能喪失及脊柱強直，對患者生活質(zhì)量及身心健康有嚴重影響，因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療具有重要意義[11]。相關(guān)研究顯示，CD4+T細胞亞群比例紊亂在AS發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，以Th1/Th2與Treg /Th17細胞免疫失衡為主要表現(xiàn)，而免疫失衡發(fā)生原因尚未明確，且細胞因子在AS發(fā)病中發(fā)揮的作用受到了越來越多的關(guān)注[12,13]。

IL-35在一系列病癥中發(fā)揮的作用受到了廣泛關(guān)注，IL-12家族內(nèi)除IL-35之外的其他成員均具備促炎功效，而IL-35具備抗炎功效，且就體內(nèi)缺少EB13的小鼠而言，其體內(nèi)存在高表達IL-17。同時，IL-35作為一種細胞因素，不僅具備免疫抑制、抗炎等一系列作用，且與多種病癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可對Treg/Th17細胞分化產(chǎn)生調(diào)控作用，對Treg細胞增殖具有促進作用，且可對Th17細胞分化及IL-17分泌產(chǎn)生抑制[14]。IL-35多由Treg細胞分泌，經(jīng)與自身受體有機結(jié)合，致使STAT1或者STAT4磷酸化進而發(fā)揮其具備的免疫抑制作用，而IL-17作為一種促炎因子，經(jīng)Th17分泌，其可誘導生發(fā)中心產(chǎn)生大量自身抗體，且與相應抗原形成免疫復合物于血管基底膜內(nèi)沉積，進而發(fā)揮組織損傷作用。IL-17與IL-35作為一對有著密切聯(lián)系的促炎/抗炎細胞因子，于生理狀態(tài)下兩種細胞因子的表達水平處于相對平衡狀態(tài)，一旦平衡失調(diào)可誘發(fā)一系列自身免疫系統(tǒng)病癥。

AS發(fā)病過程中IL-17發(fā)揮著一定作用，且與AS活動性及嚴重程度有著密切關(guān)聯(lián)，疾病活動度高的患者其IL-17表達水平更高，所以AS患者中IL-35水平的高表達，一方面可能是因為Th17細胞分泌的IL-17水平上升致使Treg細胞產(chǎn)生的IL-35反應性表達水平升高，于機體免疫反應中發(fā)揮著重要的保護作用，在此基礎(chǔ)上確保促炎/抑炎作用處于平衡狀態(tài)，另一方面可能是免疫系統(tǒng)病癥中，分泌IL-35且具備免疫抑制作用的Treg細胞數(shù)據(jù)減少或者功能缺陷，致使IL-35分泌量下降，而為了彌補IL-35免疫抑制功能下降這一缺陷，外周其他可分泌IL-35的細胞過度分泌IL-35，以對抑炎作用予以維持，降低炎性反應對組織產(chǎn)生的侵害。相關(guān)研究顯示，將重組IL-35加入CD4+T細胞亞群與胰島細胞共培養(yǎng)體系內(nèi)，可加快Treg細胞增殖，對Th17細胞分化產(chǎn)生抑制，進而對Treg /Th17比率起到調(diào)控作用，進一步增強胰島細胞活性[15]。同時，于膠原誘導的小鼠關(guān)節(jié)模型內(nèi)對IL-35進行過繼轉(zhuǎn)移，可加快Treg細胞增殖，對CD4+CD25-細胞增殖及分化產(chǎn)生抑制，在此基礎(chǔ)上減少IL-17分泌量，加快干擾素產(chǎn)生，以緩解炎性反應，減輕膠原性關(guān)節(jié)炎。相關(guān)研究顯示，刺激Treg細胞后可促使其分泌大量的IL-35，負向調(diào)控CD4+T細胞在炎癥性腸病、原發(fā)性干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等炎癥性病癥與自身免疫性病癥的發(fā)生及發(fā)展中具有重要意義，提示AS發(fā)生中IL-35可能也扮演著重要角色[16]。

IL-17作為一種炎癥性細胞因子，經(jīng)Th細胞產(chǎn)生，屬于Th17細胞的主要效應因子，可對中性粒細胞起到招募、活化作用，誘導T細胞激活，并刺激成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞產(chǎn)生多種細胞因子(IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子等)與細胞黏附分子、化學增活素產(chǎn)生，最終致使炎癥發(fā)生[17]。IL-17在AS中的作用受到了廣泛關(guān)注，AS患者關(guān)節(jié)、滑液、血清與CD4+T淋巴細胞內(nèi)IL-17呈高表達，一系列IL-17相關(guān)基因已經(jīng)被確定為AS發(fā)展的危險因素，現(xiàn)階段IL-17在AS中的作用研究主要分為兩個方面，一方面為鑒定誘導IL-17分泌的因子，另一方面為鑒定分泌IL-17的細胞類型，多種分泌IL-17的細胞與AD有著緊密聯(lián)系，如ILC、骨髓細胞等。相關(guān)研究顯示，HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)的特異性靶向HLA-B27二聚體的單克隆抗體HD5可對HLA-B27二聚體、KIR之間的相互作用產(chǎn)生抑制，使經(jīng)CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生的IL-17、TNF表達水平下降[18]。Lau等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細胞內(nèi)原型Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet處于高表達狀態(tài)，且與IL-17反應有著緊密聯(lián)系；同時，相較于野生型SKG小鼠，TBX21-/-SKG小鼠未發(fā)展為脊柱關(guān)節(jié)炎，其CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著減少，提示T-bet對IL-23受體在Th17中的表達產(chǎn)生抑制，可促使T-bet缺陷型小鼠無線分泌IL-17，且CD4+T淋巴細胞活性調(diào)節(jié)中T-bet發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在CD4+T淋巴細胞由固有層向上皮轉(zhuǎn)移期間的活性，而這一過程中它們獲取CD8a表達并喪失Foxp3表達，維持調(diào)節(jié)功能。ILC具備有限的克隆性與不變的TCR，且在刺激后可被迅速激活，如γδT細胞、黏膜相關(guān)不變T細胞等。Gracey等[20]在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，AS患者相較于健康個體，其MAIT可分娩更高水平的IL-17，且與發(fā)炎關(guān)節(jié)位置聚集，而IL-17水平上升的主要原因為IL-17啟動MAIT，由于IL-7R賦予了AS易感性，因此這一狀況可能延伸至TH17；除此之外，因為AS患者滑膜組織及外周滑液樣本內(nèi)的IL-17表達水平上升，因此研究IL-17具有可行性。Kenna等[21]在相關(guān)研究中提出，AS患者體內(nèi)IL-17分泌量明顯增加，且IL-23rDEAγδT細胞數(shù)量顯著升高。Sherlock等[22]在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，IL-23誘導的脊柱關(guān)節(jié)炎樣疾病小鼠肌腱內(nèi)發(fā)現(xiàn)了分泌IL-17的CD4-CD8-IL-23r+T淋巴細胞，且這些細胞是組織駐留的Vγ6+γδ-T淋巴細胞，但人體內(nèi)是否存在還尚未證實。AS患者IL-17水平上調(diào)提示了分泌IL-17的免疫細胞整體失調(diào)，而來自一系列免疫細胞的IL-17對AS的相對致病性尚未完全明確。相關(guān)研究顯示，IL-17水平上升與慢性炎癥性病癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系[23]。

本研究中，研究組較對照組血清IL-35水平明顯更低，且與BASDAI評分呈負相關(guān)，而IL-17水平較對照組明顯更高，且與BASDAI評分呈正相關(guān)，提示血清IL-35水平變化與IL-17相反，AS患者的病情越重，其血清IL-35水平越低，IL-17水平越高，主要在于IL-35水平下降可進一步弱化Treg細胞分化、增殖能力，致使免疫系統(tǒng)異常活化，最終喪失自身免疫耐受性，且Th細胞過度活化可導致IL-17等炎性介質(zhì)大量釋放，進一步加重炎性反應，促使疾病進展，在此基礎(chǔ)上在AS發(fā)生發(fā)展過程中起到介導作用。同時，本研究相關(guān)性分析顯示，AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關(guān)，進一步說明IL-35水平變化與Th17細胞增殖、IL-17分泌抑制減弱有著密切聯(lián)系，通過監(jiān)測血清IL-17、IL-35水平可反映AS疾病活動度。除此之外，本研究顯示，AS患者血清IL-35水平與IL-17、BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈負相關(guān)；血清IL-17水平與BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈正相關(guān)，提示AS患者血清IL-17水平上升與IL-35水平下降可能間接經(jīng)細胞免疫或體液免疫促使血清hs-CRP、ESR水平上調(diào)，致使AS炎癥發(fā)生。

綜上所述，AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關(guān)性，且血清IL-17、IL-35水平與疾病活動、炎性活動指標變化密切相關(guān)，可用于監(jiān)測AS疾病活動度；但是，由于本研究以回顧性分析為法，研究病例的選擇上缺乏客觀性，過于主觀，可能存在信息偏倚，加之樣本量較少，結(jié)果有待驗證。