抗咪唑啉酮類除草劑基因ALS627N改良粳稻品種除草劑抗性研究

李夢(mèng)臣， 馮志明，2， 崔 傲， 王廣達(dá)， 許志文， 黃 濤， 丁煒宸， 胡珂鳴，2， 陳宗祥，2， 左示敏，2

(1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

草害是影響作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素之一，是當(dāng)今農(nóng)作物育種家主要針對(duì)的難點(diǎn)之一，也是苦惱廣大農(nóng)民的一大問題。在水稻生產(chǎn)中，隨著直播稻栽培面積的不斷擴(kuò)大，稻田草害越來越嚴(yán)重。噴施除草劑是防治草害的有效手段，而除草劑對(duì)常規(guī)作物同樣具有傷害性，一定程度上限制了其使用范圍，培育及推廣抗除草劑水稻品種是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的解決雜草問題的方式，對(duì)于水稻輕簡(jiǎn)栽培、提升農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益具有重要意義。

目前，在抗不同種類除草劑的作物中，只有抗草甘膦、草胺膦及抗咪唑啉酮類除草劑作物獲得大面積的種植，其中由非轉(zhuǎn)基因手段獲得的抗咪唑啉酮類除草劑作物最受人們青睞。咪唑啉酮類除草劑是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的一類高效廣譜低毒的除草劑，目前已有6種商業(yè)化產(chǎn)品，包括咪唑乙煙酸、咪草酸、咪唑煙酸、咪唑喹啉酸、甲基咪草煙和甲氧咪草煙，能有效防除1年生禾本科雜草和闊葉雜草，其機(jī)理是通過抑制植物生物合成過程中關(guān)鍵酶乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，進(jìn)一步抑制植物體內(nèi)支鏈氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸和結(jié)氨酸等的合成，進(jìn)而抑制植物生長(zhǎng)。作物對(duì)咪唑啉酮類除草劑的抗性來自基因1個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)變化，已報(bào)道的抗除草劑位點(diǎn)包括Ala96、Ala122、Asp376、Gly95、Gly654、Pro197、Ser627、Ser653和Trp548，不同位點(diǎn)突變導(dǎo)致了不同水平的除草劑抗性。

抗咪唑啉酮類除草劑水稻在美國早已通過誘變手段被創(chuàng)制并廣泛應(yīng)用，如XL729、XL745、XP534及XP756等抗咪唑乙煙酸雜交水稻市場(chǎng)份額高達(dá)75%。近年來，我國學(xué)者也創(chuàng)制了一些抗咪唑啉酮類除草劑水稻新種質(zhì)/品種，最早通過審定的抗除草劑水稻品種是天津市水稻研究所培育的金粳818，其攜帶抗咪唑乙煙酸基因；此外，北京大學(xué)鄧興旺團(tuán)隊(duì)用EMS 誘導(dǎo)黃華占獲得的抗除草劑突變體潔田稻001，在2019年獲得新品種權(quán)；利用這些種質(zhì)，也相繼培育出一些其他抗除草劑新品種。然而，目前江蘇抗除草劑粳稻品種非常緊缺，無法適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的用種需求，雖然針對(duì)金粳818中攜帶的抗除草劑基因開發(fā)了若干緊密連鎖或功能性分子標(biāo)記，并通過標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，簡(jiǎn)稱MAS)開展了分子育種工作，初步表明在江蘇粳稻育種中具有巨大的應(yīng)用潛力，但是對(duì)于其在江蘇粳稻背景下是否會(huì)對(duì)農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)及抗病性帶來不利影響，還未有過系統(tǒng)研究。

本研究通過MAS方法將金粳818中的基因?qū)虢K省2個(gè)優(yōu)良食味粳稻品種南粳5718和南粳505中，獲得了一系列背景與受體親本基本一致、攜帶基因的高世代回交穩(wěn)定改良系，通過對(duì)改良株系進(jìn)行除草劑抗性鑒定，考察其主要農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀以及對(duì)稻瘟病、白葉枯病抗性，探討了在江蘇粳稻抗除草劑育種中的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

供體親本為金粳818，是天津市水稻研究所育成的常規(guī)優(yōu)質(zhì)粳稻品種，目的基因受體親本為江蘇省推廣的優(yōu)良食味粳稻品種南粳5718和南粳505。鑒定目的基因抗性的除草劑為咪唑乙煙酸。

1.2 回交改良系創(chuàng)制

材料創(chuàng)建流程見圖1，2016—2020年在揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)校內(nèi)基地(119°24′53″E，32°23′21″N)和海南陵水縣揚(yáng)州大學(xué)南繁基地(110°01′40″E，18°31′50″N)，以南粳5718和南粳505為母本與金粳818雜交，再分別以南粳5718和南粳505作輪回親本連續(xù)5次回交、3次自交，其間利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記RM7413對(duì)進(jìn)行“前景”檢測(cè)，低世代結(jié)合田間表型篩選，BCF和BCF世代利用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》中推薦的48個(gè)SSR標(biāo)記和左示敏等篩選獲得的用于江蘇粳稻品種鑒定的在水稻染色體上分布相對(duì)均勻的52個(gè)核心標(biāo)記(其中7個(gè)為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》中的標(biāo)記)，共93個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行背景檢測(cè)，獲得背景與輪回親本一致的BCF株系。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取單株葉片DNA，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)反應(yīng)。體系如下：10 μL 2×MIX， 0.5 μL Forward primer(10 μmol/L)，0.5 μL Reverse primer(10 μmol/L)，2 μL DNA(100 nmol/μL)，7 μL ddHO。反應(yīng)程序分為3步：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 完成后，采用 10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電壓選擇180 V，電流為200 A，時(shí)間為2 h左右，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染，最后封膠拍照并分析膠圖。

1.4 除草劑抗性鑒定

于2021年夏季在鎮(zhèn)江市京口區(qū)新民洲試驗(yàn)基地(119°33′24″E、32°16′22″N)將的高世代回交改良系和相應(yīng)對(duì)照品種進(jìn)行直播，3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)直播面積1.2 m左右。在3葉1心時(shí)，將咪唑啉哃類除草劑5%咪唑乙煙酸水劑(山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司)稀釋 1 000 倍，按300 L/hm噴霧處理，于10、20 d分別調(diào)查抗性并拍照記錄，葉片全部枯萎或死亡為感，植株存活為抗。

1.5 農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀調(diào)查

于2021年夏季在鎮(zhèn)江市京口區(qū)新民洲試驗(yàn)基地種植的高世代回交改良系和相應(yīng)對(duì)照品種，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植9行，每行50株，共450株，株行距為分別為11.1、3.00 cm?？疾斓幕巨r(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀包括株高、全生育期、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量、折合產(chǎn)量、整精米率、堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量等。

1.6 稻瘟病和白葉枯病抗性鑒定

于2021年夏季在揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)校內(nèi)基地進(jìn)行稻瘟病和白葉枯病抗性鑒定。穗頸瘟抗性鑒定菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉永峰研究員提供，選用2021年分離得到并經(jīng)過24個(gè)近等基因系鑒定具有代表性的菌株作為鑒定用菌株，分別為2021-3、2021-43、2021-71、2021-150和2021-497，共計(jì)5個(gè)菌株。穗頸瘟的鑒定采用5個(gè)菌種的混合液接種鑒定，在水稻孕穗期每穗注射1 mL混合菌液，每個(gè)品種接種6個(gè)幼穗，接種方法和病級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[14]。白葉枯病抗性鑒定菌株P(guān)X079也是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉永峰研究員提供，在水稻孕穗期，采用剪葉法進(jìn)行接種，用剪刀蘸取菌液，剪去劍葉葉尖約2 cm長(zhǎng)部分，每個(gè)品系至少接種10個(gè)單株，每個(gè)單株至少接種1個(gè)劍葉，在接種后20 d調(diào)查病斑長(zhǎng)度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016錄入和整理數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0軟件中的獨(dú)立樣本測(cè)驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用分子標(biāo)記輔助選擇獲得ALS627N高世代回交改良系

為了明確抗咪唑啉酮類除草劑基因在江蘇粳稻中的育種利用潛力，以金粳818作為抗咪唑啉酮類除草劑基因供體親本，分別與南粳5718和南粳505雜交，再以南粳5718和南粳505作輪回親本分別回交，從BCF開始利用標(biāo)記RM7413對(duì)進(jìn)行前景檢測(cè)，再結(jié)合田間農(nóng)藝性狀選擇更接近輪回親本的單株繼續(xù)回交，獲得BCF世代；對(duì)前景選擇獲得的目標(biāo)單株，再用93個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行背景檢測(cè)，南粳5718和南粳505這2個(gè)回交方向分別獲得遺傳背景與輪回親本一致的單株2株和1株，以及遺傳背景與輪回親本有1～2個(gè)位點(diǎn)雜合的單株各2株，分別收獲種植成BCF。在7個(gè)BCF群體中，分子檢測(cè)篩選出純合且遺傳背景與輪回親本一致的單株28株(南粳5718背景)和22株(南粳505背景)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖2-A所示，條帶與金粳818一致的單株即為攜帶的純合植株，部分背景檢測(cè)結(jié)果見圖2-B。

在BCF世代繼續(xù)進(jìn)行田間綜合表型篩選，最終在2個(gè)背景下各篩選獲得基本性狀與輪回親本高度相似的3個(gè)BCF穩(wěn)定改良系，分別為南粳5718R-5、南粳5718R-6、南粳5718R-9和南粳505R-2、南粳505R-7、南粳505R-12，用于接下來的綜合性狀評(píng)價(jià)。

2.2 ALS627N高世代回交改良系抗咪唑乙煙酸除草劑

為了評(píng)價(jià)高世代回交改良系對(duì)咪唑啉酮類除草劑的抗性，筆者在田間對(duì)BCF世代穩(wěn)定品系進(jìn)行了咪唑乙煙酸除草劑噴施試驗(yàn)。如圖3所示，在噴施除草劑之前，2個(gè)對(duì)照品種(南粳5718和南粳505)與改良系均生長(zhǎng)正常；當(dāng)噴施除草劑后 10 d，對(duì)照品種逐漸枯黃死亡，而不同背景下的改良系均保持生長(zhǎng)正常；當(dāng)噴施除草劑后20 d，對(duì)照品種已全部枯死，而改良系生長(zhǎng)正常，表明2個(gè)粳稻背景下的攜帶的高世代回交改良系對(duì)咪唑啉酮類除草劑咪唑乙煙酸具有很好的抗性。

2.3 ALS627N高世代回交改良系的農(nóng)藝和稻米品質(zhì)性狀

為了明確引入是否會(huì)影響農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)， 筆者考察了高世代回交改良系和相應(yīng)對(duì)照品種的基本農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀。如表1和圖4所示，總的來說，大多數(shù)改良系表現(xiàn)出與相應(yīng)的輪回親本相似的性狀。雖然在一些性狀上某些品系和對(duì)照之間存在顯著差異，但這些性狀在不同改良系中變化并不一致。如南粳505R-2和南粳505R-7表現(xiàn)出比南粳505更高的結(jié)實(shí)率，而其他改良系則表現(xiàn)出與相應(yīng)對(duì)照接近的結(jié)實(shí)率；南粳5718R-5表現(xiàn)出比南粳5718更高的堊白粒率，南粳505R-2表現(xiàn)出比南粳505更低的堊白粒率，而其他改良系則表現(xiàn)出與相應(yīng)對(duì)照接近的堊白粒率。表明這些性狀的改變與沒有緊密聯(lián)系，意味著在江蘇粳稻中引入對(duì)水稻農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)沒有緊密聯(lián)系的不利影響。

2.4 ALS627N高世代回交改良系對(duì)稻瘟病和白葉枯病的抗性

為了明確的引入是否會(huì)影響水稻對(duì)稻瘟病和白葉枯病的抗性，筆者對(duì)的高世代回交改良系和相應(yīng)對(duì)照品種進(jìn)行了抗性鑒定。如圖 5-A 所示，對(duì)照品種南粳5718和南粳505平均單穗損失率病級(jí)分別為5.6和7.3，而南粳5718背景改良系的病級(jí)在5.0～5.6之間，南粳505背景改良系的病級(jí)在7.3～7.6之間，和各自對(duì)照品種均無顯著差異。如圖5-B所示，南粳5718和南粳505的病斑長(zhǎng)度分別為18.35、18.67 cm，回交改良系的病斑長(zhǎng)度在17.55～18.6 cm之間，和各自對(duì)照均無顯著差異。這些結(jié)果表明在江蘇粳稻中引入不會(huì)影響其稻瘟病和白葉枯病抗性。

3 討論與結(jié)論

江蘇粳稻種植近年來逐漸向輕簡(jiǎn)化、機(jī)械化方向發(fā)展，直播稻的面積大幅度增加，但在直播稻田里容易發(fā)生草害，尤其是雜草稻危害，已給水稻產(chǎn)量和品質(zhì)帶來嚴(yán)重危害。目前市面上廣泛售賣和使用的除草劑雖然有很好的抑制雜草作用，但是其在消滅雜草的同時(shí)對(duì)水稻本身也帶來無法忽視的傷害，且難以清除雜草稻，這使此類除草劑的使用受到很大限制。因此，培育抗除草劑水稻品種是解決該問題的有效方式。然而，目前江蘇抗除草劑粳稻品種非常緊缺，無法適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的用種需求。咪唑啉酮類除草劑是一類廣譜內(nèi)吸性除草劑，能有效防除雜草和雜草稻，且不危害人體和牲畜，金粳818中含有抗咪唑啉酮類除草劑基因，雖然有研究表明在江蘇粳稻育種中具有巨大應(yīng)用潛力， 但是對(duì)于其在江蘇粳稻背景下是否會(huì)對(duì)農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)及抗病性帶來不利影響，還未有過深入研究。本研究結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇將金粳818中的基因轉(zhuǎn)入江蘇省2個(gè)優(yōu)良食味粳稻品種南粳5718和南粳505中，評(píng)價(jià)其在育種實(shí)踐中的應(yīng)用潛力，在每個(gè)背景下分別選擇3個(gè)背景與相應(yīng)受體親本一致的BCF世代回交改良系，除草劑抗性鑒定結(jié)果顯示，受體親本噴施后全部枯死，而改良系對(duì)咪唑乙煙酸表現(xiàn)出完全抗性，表明基因在江蘇不同粳稻背景下對(duì)除草劑咪唑乙煙酸具有很好的抗性，這與前人報(bào)道一致。

為了進(jìn)一步評(píng)估基因在生產(chǎn)應(yīng)用中是否存在負(fù)面效應(yīng)，筆者詳細(xì)比較了改良系與受體品種在一些重要性狀上是否存在差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然部分改良系中的個(gè)別品質(zhì)性狀發(fā)生一些改變，但是這些性狀在不同改良系中的變化并不呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，表明導(dǎo)入基因?qū)λ局匾?jīng)濟(jì)性狀沒有緊密聯(lián)系的不良影響。雖然筆者使用的93對(duì)分子標(biāo)記(包括農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)48對(duì)SSR標(biāo)記)在江蘇省粳稻中有很好的鑒別能力，但密度還是有限，不能完全代表整體背景，因此，這些性狀的變化可能是由于這些改良系的背景和受體品種還有輕微差異，穗頸瘟和白葉枯病的抗性鑒定也發(fā)現(xiàn)高世代回交改良系的穗頸瘟和白葉枯病抗性水平與受體親本一致，表明的引入也不會(huì)影響稻瘟病和白葉枯病抗性。這些研究表明基因在培育抗除草劑水稻品種上具很高的育種利用價(jià)值，此外，本研究選擇的受體品種南粳5718是目前在江蘇水稻生產(chǎn)上大面積推廣種植的優(yōu)良食味軟米品種，得到的抗除草劑改良系實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高，不僅有望迅速服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還可以作為抗除草劑育種新的供體，最終加快江蘇及其周邊地區(qū)抗除草劑粳稻品種的開發(fā)。