響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取山藥素Ⅰ工藝

王曉輝,胡明航,董黎明,李 靖,陳 艷,李 昭,黃 菊

(徐州工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

山藥為薯蕷的根莖，為我國傳統(tǒng)的藥食同源食物[1-2]，含有多糖、氨基酸、脂肪酸和山藥素類化合物等，具有降血糖、降血脂和抗氧化等藥理活性，廣泛用于治療糖尿病、腎炎和癌癥等臨床疾病[3-4].1972年，Hashimoto等[5]由山藥零余子中分離得到山藥素.山藥素有5種構(gòu)型，山藥中含量最高的山藥素Ⅰ是控制山藥休眠的重要因素之一，具有抗菌、抗氧化及抑制α-D-葡萄糖苷酶等生物活性的作用[3,5-7].由于山藥中山藥素類物質(zhì)的含量較低，國外研究者主要致力于研究山藥素類物質(zhì)的人工合成，但合成成本較高，產(chǎn)品價格昂貴，其藥理及生物活性研究進(jìn)展緩慢[5,8].為推動山藥及其活性成分的研究，近年來，我國學(xué)者如曹國棟[9]和朱金花等[10]建立了同時測定山藥素類化合物的HPLC法，但對精密儀器的操作要求較高；劉繡華等[11]開發(fā)了一種從植物山藥中提取山藥素的方法，但對山藥素Ⅰ的提取研究較缺乏.

為此，本文選取與山藥素Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似，在308 nm左右處有最大吸收，且具有價格低廉優(yōu)勢的9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標(biāo)準(zhǔn)品，因而山藥素含量可以9-溴菲計，由此建立了鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法.在此基礎(chǔ)上，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗并結(jié)合超聲技術(shù)，探討主要因素對鐵棍山藥中山藥素Ⅰ提取量的影響，優(yōu)化提取工藝，為山藥素Ⅰ的深入研究與開發(fā)提供依據(jù).

1 實(shí)驗部分

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥，江蘇市售；9-溴菲，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇，分析純；蒸餾水，自制.

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)，浙江萬基塑業(yè)有限公司；小型研磨機(jī)，永康市招風(fēng)耳工貿(mào)有限公司；篩子，100目；電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A，蘇州江東精密儀器有限公司；超聲波電加熱清洗機(jī)UC-2H，上海泰坦科技股份有限公司；紫外-可見分光光度計UV-5500PC，上海元析儀器有限公司；低速離心機(jī)TDL-4，上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平CN-LQC20002，昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司；容量瓶，江蘇金鑰匙科教儀器設(shè)備有限公司.

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

鐵棍山藥→洗凈去皮→切片→50 ℃干燥粉碎→過篩→乙醇浸泡→超聲提取→抽濾→離心→濾液定容.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

9-溴菲與山藥素Ⅰ的結(jié)構(gòu)類似，在308 nm左右處有最大吸收，但具有價格低廉的優(yōu)勢，本研究選擇9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法，山藥素含量以9-溴菲計.準(zhǔn)確稱量5 mg 9-溴菲，用無水乙醇溶于25 mL容量瓶中配成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.各移取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL儲備液于25 mL容量瓶中，以無水乙醇定容至刻度，搖勻、靜置15 min.配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的9-溴菲標(biāo)準(zhǔn)液.以無水乙醇為空白對照，以吸光度(A)對質(zhì)量濃度(c)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)最小二乘法得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=6.189c+0.011 9，R2=0.998 0，說明在0～0.10 mg/mL吸光度和9-溴菲濃度呈良好的線性關(guān)系.

1.3.3 鐵棍山藥山藥素Ⅰ含量測定

移取2 mL鐵棍山藥山藥素Ⅰ的提取液于25 mL容量瓶中，定容、搖勻、靜置 15 min，測定308 nm波長處吸光度.

式中：A為鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取液吸光度；V0為提取液定容體積，mL；V1為提取液定容后吸取的體積，mL；V2為稀釋液定容體積，mL；m為鐵棍山藥粉樣品質(zhì)量，g.

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

稱取過100目篩的干燥鐵棍山藥粉1.0 g，超聲功率240 W，溫度 50 ℃，分別在如下條件下進(jìn)行提取試驗.

1)液料比.在超聲時間30 min和乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時，按液料比(mL/g)10∶1～50∶1.

2)乙醇體積分?jǐn)?shù).在超聲時間30 min和液料比40∶1時，按乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～80%.

3)超聲時間.在液料比40∶1和乙醇體積分?jǐn)?shù)30%時，按超聲時間20～90 min.

分別按照章節(jié)1.3.3的方法測定鐵棍山藥山藥素Ⅰ含量，考察各單因素對山藥素Ⅰ提取量的影響.

1.3.5 Box-Behnken試驗設(shè)計

以山藥素Ⅰ提取量為響應(yīng)，以上3因素為考察變量，采用Design-expert 8.0.6軟件，利用 Box-Behnken方法設(shè)計響應(yīng)面試驗，各因素與水平見表1.

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對提取量的影響

如圖1所示，在液料比增加時，山藥素Ⅰ的提取量先增后減，在40∶1處達(dá)到最大值.因為隨著溶劑量的增多，其稀釋作用降低了山藥素Ⅰ的溶出阻力，但液料比過高時，山藥素Ⅰ的提取量反而略有下降.為了節(jié)約溶劑及降低提取成本，液料比選擇40∶1.

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取量的影響

如圖2所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時，山藥素Ⅰ的提取量也出現(xiàn)最大值.因為山藥素Ⅰ為水溶性分子，30%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液和山藥素Ⅰ的極性相當(dāng).當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，溶液極性過低，山藥素Ⅰ的溶出困難，不利于提取量的提高.過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)也加重了提取的成本，乙醇體積分?jǐn)?shù)以30%為宜.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山藥素Ⅰ提取量的影響

2.1.3 超聲時間對提取量的影響

如圖3所示，山藥素Ⅰ提取量的最大值出現(xiàn)在超聲時間為60 min處.這可能是因為超聲劇烈的振熱效應(yīng)造成部分山藥素Ⅰ破壞分解，故適宜的超聲時間為60 min.

圖3 超聲時間對山藥素Ⅰ提取量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken原理，對液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

Design-expert 8.0.6多元回歸擬合響應(yīng)值-山藥素Ⅰ提取量(Y)對編碼自變量液料比(Xa)、乙醇質(zhì)量濃度(Xb)和超聲時間(Xc)的二次多項回歸方程：

Y=0.66-0.000 75Xa-0.028Xb-0.015Xc+0.007 75XaXb-0.020XaXc-

0.015XbXc-0.080Xa2-0.037Xb2-0.019Xc2，

表3 回歸方差分析

F值反映了單因素對山藥素Ⅰ提取量的影響順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時間>液料比.由于P(XaXc)和P(XbXc)都小于0.005，表明液料比和超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對山藥素Ⅰ提取量具有顯著的交互作用，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)間的交互作用不顯著.

2.3 雙因素間的交互影響作用分析

液料比和超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取量具有顯著的交互作用.

圖4等高線反映了所考察雙因素之間的交互作用情況.當(dāng)其趨近于圓時，說明雙因素之間的相互作用不顯著，故圖4(a)的液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的兩因素相互作用較弱；當(dāng)其接近橢圓時，相互作用顯著，如圖4(b)和(c).當(dāng)曲線較為密布時，相互作用越明顯，如圖4(b)和(c).

從圖4(b)可以看出，當(dāng)液料比較低時，山藥素Ⅰ提取量隨著超聲時間的增加而遞增，當(dāng)液料比較高時，提取量隨著超聲時間先增后減；當(dāng)超聲時間較短時，提取量隨著液料比的增加略有增加，當(dāng)超聲時間較長時，提取量隨著液料比的增加而增加.從圖4(c)可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，超聲時間的增加導(dǎo)致提取量遞減，在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時，隨著超聲時間的增加提取量出現(xiàn)最大值；增加乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于增加提取量.

圖4 交互影響顯著的雙因素等高線

綜合來看，適當(dāng)?shù)卦黾映晻r間和選擇合適的液料比，或者適當(dāng)?shù)卦黾右掖俭w積分?jǐn)?shù)和選擇合適的超聲時間，均有利于提高山藥素Ⅰ的提取量.在選擇最佳工藝參數(shù)時，根據(jù)液料比45.7∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)29.2%和超聲時間63.3 min，此時山藥素Ⅰ的理論提取量為0.643 4 mg/g.實(shí)際工藝參數(shù)調(diào)整為液料比46∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)29%和超聲時間63 min，3次驗證試驗得到山藥素Ⅰ的平均提取量為 0.627 1 mg/g(RSD=1.61)，略低于理論提取量2.53%.

3 結(jié)論

1)選取具有價格低廉優(yōu)勢的9-溴菲代替山藥素Ⅰ作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了鐵棍山藥提取液中山藥素Ⅰ的紫外分光光度分析方法，為探討鐵棍山藥中山藥素Ⅰ提取量的影響因素，優(yōu)化提取工藝提供了依據(jù).

2)在此基礎(chǔ)上，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間等3個對鐵棍山藥山藥素Ⅰ提取量影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，建立了二次回歸方程.方差分析和響應(yīng)面分析表明，3因素及其2次項對提取量的影響順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時間>液料比，其中，液料比和超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間的二次交互作用顯著.該模型的統(tǒng)計學(xué)意義顯著，用于山藥素Ⅰ提取工藝的優(yōu)化較為合理，也為山藥素Ⅰ的純化、生物活性研究以及其余山藥素類成分的開發(fā)提供了研究依據(jù)和研究基礎(chǔ).