山茱萸總酚酸提取及抗菌活性成分分析

劉瑋煒，邵仲柏，陳 超，吳玉宇，蘇子欽，梁馨文，高田田，邱 敏，郭 雷

(江蘇海洋大學 a.藥學院；b.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室；c.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室；d.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

目前我國水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，由于其具有集約化程度高、規(guī)模大、密度高等特點，易導致弧菌病爆發(fā)頻率的逐步提升、傳播速度的不斷加快，嚴重影響了水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖的進一步發(fā)展[1-2].弧菌性疾病是危害水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖最嚴重的疾病之一[3-4]，水產(chǎn)養(yǎng)殖中如弧菌病治理不當，易引發(fā)食品安全問題，給人類健康帶來巨大危害[5-6].當前，治療弧菌病主要使用抗生素類藥物，但其長期過量使用，不僅導致水生環(huán)境中的弧菌產(chǎn)生耐藥性，而且水產(chǎn)品中的殘留給人體健康帶來巨大危害[7-8].大多數(shù)中草藥具有廣譜抗菌、來源廣、價格便宜、綠色安全、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[9-10]，與抗生素作用不同，在防控疾病方面主要是通過提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的非特異性免疫而達到抗菌效果的[11]，所以用中草藥替代抗生素作為新型弧菌抑制劑在我國具有較高的研究價值.

山茱萸(Cornusofficinalis)作為山茱萸科植物[12]，在我國分布范圍廣泛，其藥用價值高[13-14]，最早被《神農本草經(jīng)》所記載.山茱萸中有效成分的生物活性眾多，如抗菌、抗氧化、利尿、抗癌等[15-16].Shu等[17]認為山茱萸酚酸類物質能較好抑制金黃色葡萄球菌與金芽孢桿菌.Brindza[18]研究發(fā)現(xiàn)山茱萸中熊果酸對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和黑曲菌均有較強的抑制作用.本課題組前期首先進行了山茱萸、沙棘、藿香等13種中草藥抑制哈氏弧菌、副溶血弧菌活性的篩選實驗，并將山茱萸乙醇提取物與陽性對照大蒜素進行活性對比，發(fā)現(xiàn)13種中草藥中山茱萸乙醇提取物抑制弧菌活性最好，同時山茱萸乙醇提取物的活性強于大蒜素；其次，利用大孔吸附樹脂柱層析和薄層層析法對山茱萸乙醇提取物進行分離得到了3個組分，并采用化學定性檢測法對3個組分進行鑒定，初步判定山茱萸抑菌活性成分為酚酸類化合物.因此，本研究對山茱萸總酚酸提取工藝[19]進行優(yōu)化，對其抗弧菌活性成分進行初步研究，以期為山茱萸總酚酸資源開發(fā)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中弧菌性疾病防治提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸粉末，購自安徽毫州中藥廠，過80目篩，備用；指示菌為哈氏弧菌，購自中國普通微生物菌株保藏管理中心，由本實驗室保存.

試驗用沒食子酸(CAS號：149-91-7)、Folin-酚試劑，江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司；MH肉湯、海鹽、瓊脂粉，上海藍季生物有限公司；無水乙醇(EtOH)、石油醚(PE)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(nBuOH)為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；柱色譜硅膠(200～300目)、Sephadex LH-20凝膠柱，Pharmacia公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 山茱萸總酚酸的提取

定量稱取干燥的山茱萸粉末10.0 g，置于500 mL三口瓶中，加入150 mL一定體積分數(shù)的乙醇溶液，設置超聲功率225 W、超聲溫度50 ℃.在一定時間內，先超聲破碎，后回流提取，減壓抽濾，重復2次.收集2次濾液后濃縮，置于10 mL容量瓶中進行定容，測定其在755 nm波長處的吸光值.

1.2.2 山茱萸總酚酸提取得率的測定

1.2.3 單因素試驗

分別考察乙醇含量(體積分數(shù)20%、40%、60%、80%、100%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、超聲持續(xù)時間(15、30、45、60、75 min)、回流時間(30、60、90、120、150 min)和回流溫度(30、40、50、60、70 ℃)對山茱萸中總酚酸提取得率的影響.

1.2.4 Plackett-Burman篩選試驗中的關鍵因素

以單因素的試驗結果為基準，將總酚酸得率視為響應值(Y)，對乙醇含量(X1)、液料比(X2)、超聲持續(xù)時間(X3)、回流時間(X4)及回流溫度(X5)5個影響因素進行評價，篩選出主效應因子，每個因素取最低(-1)和最高(1)2個水平，共12組試驗.主要試驗因素和水平的取值見表1.

STS教育就是在STS思想指導下，為培養(yǎng)了解科學技術、能積極參與科學技術相關社會問題的決策、具有一定科學素養(yǎng)的公民而進行的一種教育，突出科學技術在個人和社會方面的應用以及科學、技術和社會之間的相互作用。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素和水平

1.2.5 響應曲面法優(yōu)化試驗

以Plackett-Burman的試驗設計結果為基礎，通過選擇乙醇含量(A)、超聲持續(xù)時間(B)、回流時間(C)3個因素，完成了3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，以篩選最佳工藝.具體試驗因素和水平的取值見表2.

表2 Box-Behnken試驗設計的因素和水平

1.2.6 抗弧菌活性成分分析

將提取的山茱萸總酚酸溶液進行減壓濃縮，得到山茱萸浸膏.用適量蒸餾水溶解浸膏，依次用PE、DCM、EA、nBuOH萃取，減壓濃縮，得到5個不同萃取部位.結合不同極性部位對哈氏弧菌的抑制效果進行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)EA部位抗哈氏弧菌活性最強，故而確定其作為下一步研究對象.

過硅膠柱，以DCM∶MeOH(10∶1～0∶1)進行洗脫，分離出7個組分(Fr.1～Fr.7).通過活性追蹤，將抗哈氏弧菌活性最強的組分Fr.6再次過硅膠柱，以DCM∶MeOH(20∶1～0∶1)進行洗脫，分離出組分Fr.6.1～Fr.6.6，其中Fr.6.2(化合物1)為淡黃色結晶.但此時通過活性追蹤發(fā)現(xiàn)，組分Fr.6.5活性最強，故對其進行凝膠柱層析，以MeOH為洗脫劑，TLC點樣，相同組分合并，得到組分Fr.6.5.1～Fr.6.5.5，其中Fr.6.5.4(化合物2)為白色結晶.利用1H NMR、13C NMR及ESI-HRMS對化合物1、2進行結構鑒定.

2 結果與分析

2.1 單因素對山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對山茱萸總酚酸得率的影響

當乙醇體積分數(shù)為20%～60%時，山茱萸總酚酸得率隨著乙醇體積分數(shù)上升而升高，并在60%時達到最高，而當乙醇體積分數(shù)為60%～100%時，總酚酸得率逐漸下降(圖1).乙醇與水按照不同比例混合后配成梯度濃度溶劑，而不同梯度濃度的乙醇溶液對植物中化學物質溶出度有一定影響，因此確定乙醇體積分數(shù)為60%.

圖1 乙醇體積分數(shù)對山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.2 液料比對山茱萸總酚酸得率的影響

圖2 液料比對山茱萸總酚酸得率的影響

2.1.3 超聲持續(xù)時間對山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率在超聲持續(xù)時間為60 min時達到最大，而當超聲持續(xù)時間大于60 min時，得率急劇下降(圖3).其原因可能是當超聲持續(xù)時間為60 min時，山茱萸中總酚酸質量濃度與60%乙醇提取溶劑中總酚酸的質量濃度達到動態(tài)平衡；而當其超過60 min后，超聲處理會明顯升溫，造成物質活性喪失，故得率隨之下降.因此，確定超聲持續(xù)時間為60 min.

圖3 超聲持續(xù)時間對總酚酸得率的影響

2.1.4 回流時間對山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率隨著回流時間增加而增大，到120 min時達到最大，隨后下降(圖4).這可能是因為隨著提取時間延長，總酚酸被氧化導致得率下降.因此,確定回流時間為120 min左右.

圖4 回流時間對總酚酸得率的影響

2.1.5 回流溫度對山茱萸總酚酸得率的影響

山茱萸總酚酸得率在溫度為50 ℃時達到最大.當溫度超過50 ℃時，得率呈緩慢下降趨勢(圖5).推測是由于總酚酸類物質熱穩(wěn)定性不好，長時間高溫加熱易被氧化，導致部分總酚酸類物質丟失，得率下降.因此,選擇回流溫度為50 ℃左右.

圖5 回流溫度對總酚酸得率的影響

2.2 關鍵因素的確定

采用Design-Expert 10.0.7軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到山茱萸總酚酸得率為響應值的最優(yōu)方程為：Y=3.043+0.196X1+0.057X2-0.106X3-0.115X4+0.068X5，且得到方差分析結果，見表4.由表4數(shù)據(jù)，根據(jù)效應值的大小可知影響山茱萸總酚酸得率的關鍵因素依次為：X1>X3>X4>X5>X2.其中乙醇含量X1、超聲持續(xù)時間X3對山茱萸總酚酸得率的影響達到極其顯著水平(P<0.01)，回流時間X4則達到顯著水平(P<0.05)，而回流溫度X5和液料比X2影響不顯著.故選擇乙醇含量、超聲持續(xù)時間、回流時間3個關鍵因素進一步進行響應面優(yōu)化實驗.通過觀察單因素實驗的結果，并綜合考慮成本、效率等方面，將液料比和回流溫度這2個因素分別固定為15∶1(mL/g)和50 ℃.

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 Plackett-Burman試驗方差分析結果

2.3 響應面分析的優(yōu)化

采用Design-Expert 10.0.7軟件對表5中數(shù)據(jù)進行處理，獲得總酚酸得率(Y)對乙醇含量(A)、超聲持續(xù)時間(B)以及回流時間(C)的二次多項回歸方程：Y=4.27+0.20A+0.22B-0.24C+0.11AB+0.061AC+0.17BC-0.43A2-0.80B2-0.59C2.對回歸模型進行方差分析，結果見表6.由表6數(shù)據(jù)可知，該回歸模型P<0.000 1(極顯著)，失擬項P=0.906 5>0.05(不顯著)，說明該回歸模型可靠，可用于山茱萸總酚酸得率的優(yōu)化.并且，模型決定系數(shù)R2為0.992 5，表明擬合度較好；校正決定系數(shù)R2為0.982 8，表明預測值與實際值相關性高，所以此回歸模型可用于分析、預測山茱萸總酚酸得率.此外，在該回歸模型中，二次項AB對山茱萸總酚酸得率的影響達到顯著水平(P<0.05)，而A、B、C以及BC、A2、B2、C2則為極顯著水平(P<0.01)，AC無顯著影響.各因素響應面如圖6所示.

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

表6 回歸模型方差分析結果

圖6 各因素響應面圖

2.4 驗證性試驗結果

通過軟件進一步分析得到最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)62.35%、超聲持續(xù)時間61.33 min、回流時間116.53 min.在此條件下，山茱萸總酚酸得率最大理論值為4.324 mg/g.考慮到實際生產(chǎn)條件，將最佳工藝條件調整為乙醇體積分數(shù)60%、超聲持續(xù)時間60 min、回流時間115 min.在該條件下進行平行試驗驗證，測得總酚酸得率平均值為4.307 mg/g，而預測值為4.324 mg/g，兩者結果接近，相對誤差為0.39%，表明該模型具有較高的準確度.

2.5 活性成分結構表征

化合物1：淡黃色固體，ESI-MS m/z 171.026 7[M+Na]+；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:4.35(dd,J=7.5, 5.1 Hz, 1H,C-H),3.63(s,3H,CH3), 2.63(dd,J=15.8, 5.1 Hz,1H,CH),2.49(dd,J=15.8,7.5 Hz,1H,CH).13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ=173.82(C-1),172.05(C-2),67.48(C-3),52.10(C-4),39.60(C-5).通過與文獻[21]數(shù)據(jù)對比，確定化合物1為2-羥基丁二酸-1-甲酯，其結構式見圖7.

圖7 化合物1的結構

化合物2：白色無定形粉末，ESI-MS m/z 169.0163[M-H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:12.21(s, 1H, COOH),9.18(s, 2H, OH),8.81(s, 1H, OH),6.92(s, 2H, Ph-H);13C NMR(126MHz, DMSO-d6)δ:167.93(C-7),145.8(C-2,6),8.81(C-4),109.19(C-3,5).通過與文獻[22]數(shù)據(jù)對比，確定化合物2為3,4,5-三羥基苯甲酸(沒食子酸)，其結構式見圖8.

圖8 化合物2的結構

3 結語

通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗以及Box-Behnken設計，優(yōu)化山茱萸總酚酸提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為液料比15∶1 mL/g、回流溫度50 ℃、乙醇體積分數(shù)60%、超聲持續(xù)時間60 min、回流時間115 min.在該條件下，山茱萸總酚酸的得率為4.307 mg/g.另外，通過硅膠柱、凝膠柱層析及活性追蹤，初步探究山茱萸中抑制弧菌的活性成分，最終分離得到2個化合物,即2-羥基丁二酸-1-甲酯和沒食子酸.本文為山茱萸抑制弧菌活性成分的進一步研究提供了借鑒，以求推動水產(chǎn)抗菌藥的開發(fā).