DNA去甲基化特征、功能及其在節(jié)肢動物中的研究現(xiàn)狀

劉逸塵，何雨欣，張亦陳，孫金生

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

生物性狀的表達不僅受基因控制，還受環(huán)境的影響.在環(huán)境影響下，生物基因未改變但表型發(fā)生可遺傳變化的現(xiàn)象稱為表觀遺傳，涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、非編碼RNA調控等過程，其中研究最為廣泛的是DNA甲基化[1].DNA甲基化是DNA的修飾方式之一，常見的修飾方式為DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化S-甲硫腺苷（SAM）的1個甲基轉移到胞嘧啶（C）5號碳原子上，產(chǎn)生5-甲基化胞嘧啶（5mC），這種修飾作用可以影響轉錄因子、甲基化結合蛋白以及染色體結構，從而影響基因表達，參與轉座因子沉默、基因組印記和X染色體失活等多種生物學過程.動物中最常見的為CpG二核苷酸位點中的甲基化，但基因組DNA甲基化的實際模式是高度可變的，尤其是在脊椎動物和無脊椎動物之間.無脊椎動物具有與脊椎動物類似的甲基化模式，但大部分的甲基化水平較脊椎動物低，還存在CHG（H代表A/T/C）和CHH序列上的甲基化修飾，例如果蠅（Drosophila melanogaster）中存在的CpA、CpT甲基化修飾以及菜蛾（Plutella xylostella）中存在的5′-CCGG-3′序列甲基化修飾[2].

DNA甲基化是動態(tài)變化的，它的異常可能會產(chǎn)生癌癥、基因印記以及精神相關疾病的風險[3-4].作為DNA甲基化的逆向過程，DNA去甲基化在動物發(fā)育、腦可塑性、基因組印記等過程和由環(huán)境損傷引起的表觀基因調控中具有高度靈活性[5]，因此正常的DNA去甲基化修飾在維持DNA甲基化調控的穩(wěn)定性方面具有重要作用.深入了解DNA去甲基化，能夠完善對DNA甲基化動態(tài)調控的認識，這不但能拓寬人們對表觀遺傳調控的理解，還對體細胞重編程、再生醫(yī)學以及醫(yī)學治療等具有重要意義.相比脊椎動物，DNA去甲基化在無脊椎動物中研究得較少，其中對節(jié)肢動物的研究大多聚焦在昆蟲當中.本文對DNA去甲基化的機制、功能及其在節(jié)肢動物中的研究現(xiàn)狀進行綜述，以期為甲殼動物DNA去甲基化的研究提供借鑒和參考.

1 DNA去甲基化的方式及其作用機制

DNA去甲基化涉及被動和主動2種方式.被動去甲基化主要發(fā)生在細胞分裂時期，其實質是在DNMT被抑制的前提下通過DNA的復制對甲基化進行稀釋，并不能完全去除DNA的甲基化標簽.Leu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，小的干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）干擾卵巢癌細胞中的DNMT1和DNMT3b會引起部分基因位點的去甲基化，從而恢復基因表達，這也進一步說明了抑制DNMT的活性可以引起被動去甲基化.而主動去甲基化則不需要依靠DNA復制，早在1986年Razin等[7]就提出分化過程中的DNA去甲基化是通過一種酶反應機制實現(xiàn)的，即5mC被C取代.主動去甲基化的途徑如圖1[8-9]所示，共分為4種[10]：①堿基切除修復途徑（base excision repair，BER），堿基切除修復過程中直接切除5mC并啟動DNA糖基化酶來實現(xiàn)主動DNA去甲基化，這種機制多見于植物中；②脫氨基-錯配修復途徑，胞苷脫氨基酶（cytidine deaminase，CDA）可以催化5mC轉變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），產(chǎn)生的G∶T易突變體激活錯配修復，錯配修復將T修復為C從而達到去甲基化的目的[11]；③TET-糖基化酶-切除修復途徑，這是研究最為廣泛也最公認的去甲基化途徑[10-11]，易位甲基胞嘧啶雙加氧酶（ten-eleven translocation，TET）蛋白是一種依賴α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+的雙加氧酶，TET蛋白能夠將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），并進一步將5 hmC氧化成甲酰胞嘧啶（5fC）、羧基胞嘧啶（5caC）[12]，隨后被T-DNA糖苷酶（TDG）或U-DNA糖苷酶（UDG）識別切除產(chǎn)生一個無堿基位點，進而經(jīng)過堿基切除修復途徑被修復為無修飾的胞嘧啶[13-14]；④TET-脫氨基偶聯(lián)途徑，TET將5mC氧化為5hmC，CDA催化5hmC脫氨基產(chǎn)生的5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）被TDG識別切除，達到去甲基化的目的[15-16].

圖1 哺乳動物中DNA甲基化以及去甲基化途徑Fig.1 DNA methylation and demethylation pathways in mammals

主動去甲基化與被動去甲基化過程并非完全獨立和相互排斥，甚至存在關聯(lián).例如，哺乳動物生殖細胞發(fā)育過程中以及受精后均會伴隨全基因組的去甲基化，其中，在合子基因組的去甲基化過程中，母系和父系基因組利用了不同的去甲基機制，父系基因組主動去甲基化，而母系基因組被動去甲基化[17].

2 DNA去甲基化的功能

哺乳動物中存在不同形式的DNA甲基化模式，包括啟動子和非啟動子的甲基化.啟動子上的DNA甲基化通常會抑制基因表達，因此其變化在基因表達中具有開關的作用，對維持生物正常的細胞功能、遺傳印記和胚胎發(fā)育極其重要.DNA去甲基化作為DNA甲基化修飾動態(tài)變化中的關鍵過程，與甲基化的作用緊密相關.

2.1 調控發(fā)育進程

DNA甲基化的動態(tài)調控對生物胚胎和腦的發(fā)育具有重要作用.在有性生殖中，基因組甲基化共發(fā)生2次動態(tài)變化，如圖2[18]所示.一次發(fā)生在生殖細胞發(fā)育時期：原始生殖細胞需要經(jīng)過被動的全基因組去甲基化以及主動的特異性去甲基化，消除體細胞中的特異甲基化修飾，隨后在生殖細胞形成和配子發(fā)生過程中建立性別和生殖細胞特異性DNA甲基化模式，形成基因組印記，以便完成高度復雜化和專業(yè)化的減數(shù)分裂和受精過程；另一次則發(fā)生在早期胚胎發(fā)育時期：受精后的配子去除了除基因印記區(qū)和轉座子以外的大部分甲基化標記，之后又在胚胎著床前重建DNA甲基化模式[18].Inoue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TET1缺失的小鼠胚胎干細胞不僅呈現(xiàn)出形態(tài)學異常，還表現(xiàn)出生長速率的下降.此外，相關研究表明，DNA去甲基化在神經(jīng)元發(fā)育中起著關鍵作用，DNA去甲基化的異常通常伴隨著雷特綜合征、孤獨癥、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生.Szulwach等[20]研究腦發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，5 hmC的獲得與激活發(fā)育基因有關.5hmC、5fC和5caC是DNA去甲基化過程中關鍵的中間體，它們的含量在神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)干細胞分化過程中表現(xiàn)出時空差異性，TETs也具有類似的時空特異性表達[21]，這也表明發(fā)育過程中DNA去甲基化可能有助于調節(jié)基因的正確表達.

圖2 DNA甲基化水平在配子發(fā)育以及早期胚胎發(fā)育時期的變化Fig.2 Changes of DNA methylation level during gametogenesis and embryogenesis

2.2 參與免疫防御過程

腫瘤形成與DNA去甲基化的異常有關.在髓系惡性腫瘤中首次發(fā)現(xiàn)的TET2突變基因使學者們逐漸關注TET2在免疫調節(jié)中的作用，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TET2丟失會使肥大細胞基因表達發(fā)生中斷且基因組甲基化模式發(fā)生改變，從而影響肥大細胞的分化和細胞因子的產(chǎn)生[22].進一步研究發(fā)現(xiàn)，TET2還參與了調控機體的炎癥反應：漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）在病毒感染初期具有呈遞抗原以及誘發(fā)炎癥反應的重要作用，CXXC5（CXXC finger protein 5）招募TET2以促進干擾素調控因子IRF7的表達，從而參與調控干擾素IFN-α的表達，其誘導的IFN反應被證明與誘導T細胞反應密切相關[23].TET2還能改變mRNA的甲基化模式.巨噬細胞TET2被ADAR1招募于細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）mRNA的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）上，引起SOCS3 mRNA的降解從而解除對JAK/STAT3通路的抑制[24].而炎癥消退時，巨噬細胞中TET2結合組蛋白去乙?；?/2（HDAC1/2）以促進組蛋白脫乙?；⒁种瓢捉樗豂L-6和IL-1β的表達，也表明TET2參與的表觀遺傳調控是解決炎癥的關鍵因素[25-26].

除此之外，組織特異性DNA去甲基化近年來也被認為是免疫T細胞和B細胞正常分化和作用所必需的，如圖3所示[26-27].全基因組繪制5hmC圖譜發(fā)現(xiàn)，5hmC富集與基因表達正相關，5hmC不僅在一些關鍵的T細胞譜系特異性轉錄因子（如Th-POK、T-bet、Foxp3等）基因體中沉積，還在免疫應答相關基因（如IL-4、IFNγ和IL-17）的轉錄區(qū)域中富集，促進表達以調控T細胞的分化和功能[27].TET2的突變會導致CD4-T淋巴細胞異常增殖以破壞T細胞的穩(wěn)定性[28].TET2和TET3 mRNA在B細胞發(fā)育的各個階段都大量表達.與正常小鼠相比，TET2/3缺失的小鼠骨髓中B細胞數(shù)量顯著減少，并且從pro-B發(fā)育到pre-B的過程中出現(xiàn)部分阻滯，TET2/3的缺失還導致干擾素調控因子IRF4表達降低，損害免疫球蛋白Igκ的轉錄和重排[29-30].TET1蛋白可以通過調控組蛋白H4的乙酰化水平影響DNA修復，也表明了DNA去甲基化在免疫調控、腫瘤抑制以及DNA修復中有著重要作用[31-32].

圖3 TETs介導的DNA去甲基化在免疫相關應答中的調控Fig.3 Regulation of TETs-mediated DNA demethylation in immune-related responses

2.3 影響代謝通路

機體正常的新陳代謝與DNA甲基化的動態(tài)調節(jié)有著密切關聯(lián)：一方面，DNA甲基化的動態(tài)修飾離不開機體代謝，其中用于修飾DNA的甲基來源于甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸，而參與去甲基化過程的TET雙加氧酶活性也受到三羧酸循環(huán)中αKG的影響（圖1）；另一方面，在二型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)基因甲基化異常導致胰島素和胰高血糖素分泌紊亂，這也表明了DNA甲基化對代謝的影響[9].高糖飲食會引發(fā)轉化生長因子（transforming growth factor β1，TGFβ1）基因的去甲基化和表達，這在糖尿病和腎病的發(fā)病機制中起著關鍵作用[33].另外，TET2可調控脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的表達，對甘油三酸酯的代謝有重要作用，TET2過度表達會顯著抑制動脈粥樣硬化病變的形成，這也給代謝紊亂引發(fā)的疾病提供了一個潛在的新治療靶點[34].

2.4 潛在調控物種進化

基于DNA甲基化的動態(tài)調控作用，人們逐步開始探究DNA甲基化動態(tài)修飾在物種進化上的作用，DNA去甲基化引起的DNA甲基化水平改變可能會導致物種特異性適應以及表型變異.人類和黑猩猩的基因組具有95%的同源性，但逆轉錄轉座子SVA的甲基化在人類和黑猩猩精子中顯示出明顯的物種特異性差異，SVA在人類精子中表現(xiàn)出低水平的甲基化而在黑猩猩精子中顯示出高水平的甲基化，這種變化暗示了DNA去甲基化在進化中的調控作用[35].在脊椎動物中，DNA甲基化常發(fā)生在CpG二核苷酸序列上，CpG含量的變化也為甲基化水平的變化提供了一種機制，CpG含量降低可由甲基化胞嘧啶引起的快速脫氨基引起，使CpG轉化為TpG[36].Gokhman等[37]在此基礎上推斷了尼安德特人和杰尼索萬人的DNA甲基化模式，并觀察到現(xiàn)代人中HOXD9啟動子和HOXD10基因體的甲基化水平低于古人類中的甲基化水平，HOXD是調控肢體發(fā)育的關鍵蛋白，它在進化中發(fā)生的去甲基化可能解釋了古人類與現(xiàn)代人類之間的一些解剖學差異[37-38].

3 節(jié)肢動物DNA去甲基化的研究現(xiàn)狀

3.1 節(jié)肢動物去甲基化的機制

對節(jié)肢動物的全基因組進行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化存在于肢口綱（美洲鱟）、唇足綱（蜈蚣）、蛛形綱（腹蛛）、甲殼綱（大型溞）以及昆蟲綱中，DNA甲基化的水平因物種而異，節(jié)肢動物DNA甲基化的機制以及分布如圖4和表1[39-40]所示.在昆蟲綱中，除雙翅目外，DNA甲基化廣泛存在于幾個當前研究比較廣泛的目中，如蜚蠊目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鱗翅目等.結合DNA甲基化轉移酶檢測發(fā)現(xiàn)，這些昆蟲的DNA甲基化水平與DNMT1有相關性，與DNMT3之間則缺乏相關性[41].DNMT1和DNMT3在哺乳動物中分別具有催化半甲基化為全甲基化和對DNA進行從頭甲基化的功能，但目前沒有直接證據(jù)證明節(jié)肢動物中DNA從頭甲基化由DNMT3介導.缺乏DNA甲基化的雙翅目昆蟲中只發(fā)現(xiàn)了DNMT2，這也與DNMT2催化tRNA甲基化的發(fā)現(xiàn)相符[40-42].基于DNMT重要的甲基化作用，其活性受到抑制以及表達受到干擾會使節(jié)肢動物產(chǎn)生被動的去甲基化.Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術敲降黃蜂（Nasonia vitripennis）的DNMT1基因能夠顯著降低全基因組甲基化水平，表明具有甲基化修飾的節(jié)肢動物存在DNA被動去甲基化修飾.

圖4 節(jié)肢動物中DNMT和TET介導的DNA甲基化和去甲基化途徑Fig.4 DNA methylation and demethylation mediated by DNMT and TET in arthropods

表1 節(jié)肢動物中DNMT和TET的分布Tab.1 Distribution of DNMA and TET in arthropods

節(jié)肢動物表現(xiàn)出與哺乳動物不同的甲基化模式.節(jié)肢動物DNA的甲基化往往以鑲嵌模式稀疏地分布，甲基化多發(fā)生于基因的編碼區(qū)且高度富集于編碼保守蛋白的基因中，而在基因之間以及轉錄因子中的甲基化較少，啟動子更缺少甲基化[39]；相比于哺乳動物，部分節(jié)肢動物在CpG島的甲基化水平較低，但存在CpT和CpA位點上的甲基化.常發(fā)生在細菌基因組中的腺嘌呤甲基化修飾（6mA）也存在于雙翅目的果蠅中，并且在果蠅胚胎發(fā)育過程中具有潛在的調控作用[43].

哺乳動物中TET1/2/3蛋白在介導DNA主動去甲基化過程中有重要作用，在含有5hmC的節(jié)肢動物中也檢測到了參與DNA主動去甲基化的關鍵酶類TETs，包括蚜蟲（Diuraphis noxia）[44]、黃蜂[45]和蜜蜂（Apis mellifera）[46]等.不同于哺乳動物中常見的TET1/2/3蛋白，部分節(jié)肢動物中含有一個TET同系蛋白，即DNA甲基腺嘌呤脫甲基酶（DNA N6-Methyladenine demethylase，DMAD）.Engelhardt等[40]研究發(fā)現(xiàn)，敲降果蠅的DMAD可導致6mA積累，經(jīng)體外實驗證明DMAD可介導6mA去甲基化.載脂蛋白B催化編輯蛋白家族（apolipoprotein B editing complex proteins，APOBECs）是常見于哺乳動物中的另一種去甲基化酶，雖然發(fā)現(xiàn)在無脊椎動物海膽中也存在該種酶[47]，但對于節(jié)肢動物中APOBECs催化5mC脫氨基的研究尚未開展.雖然已經(jīng)證明節(jié)肢動物中存在TET介導的DNA去甲基化修飾，但TET蛋白修飾后產(chǎn)生的5hmC是否經(jīng)切除修復還原成未甲基化的胞嘧啶，仍需要進一步探討.

3.2 節(jié)肢動物中DNA去甲基化功能的研究現(xiàn)狀

哺乳動物中存在的啟動子甲基化模式一般具有抑制效應.在昆蟲中高度甲基化的基因通常具有管家基因功能，可以進行高效表達；而低水平甲基化的基因則可能與復雜的基因表達調控有關[48]，其中可能涉及調控組蛋白修飾和選擇性剪接.多項研究發(fā)現(xiàn)，DNA去甲基化對于節(jié)肢動物的發(fā)育、免疫防御、代謝以及進化具有重要影響，具體如表2所示.

表2 DNA去甲基化在節(jié)肢動物的發(fā)育、免疫防御、代謝以及進化中的調控作用Tab.2 Regulation of DNA demethylation in the development，immune defense，metabolism and evolution of arthropods

在發(fā)育方面，Kucharski等[49]首次在蜜蜂中得到啟發(fā)，即昆蟲的等級分化與表觀遺傳修飾密切相關，DNMT3基因的沉默會使西方蜜蜂幼蟲發(fā)育成具有成熟卵巢的蜂皇.保幼激素（juvenile hormone，JH）是昆蟲等級發(fā)育的關鍵因子，Cardoso-Júnior等[50]研究發(fā)現(xiàn)，無刺蜜蜂中低DNA甲基化水平能夠上調保幼激素的表達，DNA甲基化和組蛋白磷酸化協(xié)同修飾，增加幼蟲發(fā)育成蜂皇的可能.除此之外，F(xiàn)eliciello等[57]在赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與調控胚胎發(fā)育成蟲.Pegoraro等[45]研究發(fā)現(xiàn)，RNAi敲降黃蜂的Dnmt1a基因后在長日照條件下滯育發(fā)生率異常增加，表明甲基化對黃蜂正常光周期反應具有調控作用.Sp-CFSH（甲殼類雌性激素基因）是擬穴青蟹（Scylla paramamosain）性別分化的關鍵基因，該基因5′端的轉錄起始位點含有1個CpG島，Jiang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，定點突變與轉錄因子Sp1結合相關的CpG位點降低了啟動子活性，表明甲基化可能通過阻斷轉錄因子結合從而抑制Sp-CFSH表達.

在免疫防御方面，無脊椎動物不同于脊椎動物，僅具有天然免疫而不具有適應性免疫.DNA甲基化調控可能通過改變抗病和免疫相關基因的表達進而影響生物的免疫能力.家蠶（Bombyx mori）感染BmNPV病毒后會發(fā)生轉錄譜的變化，與正常家蠶相比有多個差異甲基化基因，其中包含參與JAK/STAT通路以及抗凋亡過程的相關基因，Huang等[53]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT活性降低可以引起這些相關基因下調，促進感染細胞的凋亡，推測DNA去甲基化在抑制BmNPV病毒增殖方面有重要作用.Li-Byarlay等[54]對感染了IAPV的蜜蜂進行甲基化分析和轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化的快速變化先于并可能觸發(fā)更廣泛的轉錄組變化.Kumar等[55]用甲基化抑制劑處理小菜蛾（Plutella xylostella）時也發(fā)現(xiàn)基因組的5mC水平降低與免疫抑制有關，DNMT的表達和基因組的甲基化水平在被寄生蜂寄生后第3天發(fā)生顯著降低；此外，他們還發(fā)現(xiàn)小菜蛾的5mC水平在被寄生的第2天顯著升高，推測有可能是由于PxTET下調減少了5mC去甲基化代謝從而暫時增加了宿主防御能力.

在代謝方面，節(jié)肢動物具有與脊椎動物類似的現(xiàn)象，即某一特定基因的去甲基化能夠影響相關的代謝調控.Foret等[56]將蜂王和工蜂幼蟲的全基因組甲基化特征與基因表達和激素調節(jié)聯(lián)系起來發(fā)現(xiàn)，幾個高度保守的代謝和信號通路中富含甲基化基因，其中一個為差異甲基化區(qū)域編碼間變性淋巴瘤激酶（ALK），ALK是新陳代謝重要的調控因子，這表明DNA甲基化表觀遺傳機制影響代謝通量和信號轉導.

在進化方面，DNA去甲基化對節(jié)肢動物表型調控以及社會性分工具有調控作用.SAM蚜蟲是從親本SA1發(fā)展而來的一類更具毒性的生物型蚜蟲，SAM比其親本SA1具有更高的DNA甲基化調控活性，這可能是SAM能克服植物抗性的基礎[44].社會性膜翅目昆蟲表現(xiàn)出一定的DNA甲基化相似性和特異性，具有較高CpG含量的同時也存在DNA甲基化的基因調控[58]，如具有社會性分工的蜜蜂，它們不同于果蠅，前者具有較高的CpG含量，且甲基化基因與脊椎動物的更相似[59].

目前有關于節(jié)肢動物DNA甲基化調控的研究給予了研究者許多啟發(fā)，提出了進一步的思考：節(jié)肢動物是否具有與哺乳動物類似的主動去甲基化模式？環(huán)境變化是通過怎樣的信號通路激活和調控相應的DNA甲基化調控通路？節(jié)肢動物中DNA甲基化是如何調控基因表達的？這種表達調控如何影響生物表型的變化？DNA甲基化調控如何與其他的表觀遺傳網(wǎng)路協(xié)調合作以調控生物表型的變化？

4 結論和展望

作為重要的表觀遺傳修飾之一，DNA甲基化動態(tài)調控已在哺乳動物中得到廣泛研究，DNA去甲基化是機體維持正常DNA甲基化水平所必須的.哺乳動物的被動去甲基化和主動去甲基化協(xié)調合作，使生物機體維持穩(wěn)定的DNA甲基化水平從而維系正常的生理活動，亦或改變機體的甲基化水平以應答環(huán)境變化.DNA去甲基化會引起哺乳動物生理功能的變化，其原因在于相關基因的甲基化水平發(fā)生改變，從而影響了它的表達水平.因此，甲基化與基因表達之間的相關性成為探究節(jié)肢動物DNA去甲基化功能和機制的關鍵問題之一.首先DNA甲基化作為保守的表觀修飾之一，已在節(jié)肢動物中得到印證；其次，節(jié)肢動物中觀察到的甲基化模式以及生理功能變化時發(fā)生的差異甲基化，暗示了DNA去甲基化與基因表達間的潛在關系，但節(jié)肢動物DNA去甲基化與基因表達是否有直接關系還未可知.節(jié)肢動物的甲基化常發(fā)生在基因體中，這種修飾常被認為調控轉錄本的選擇性剪接和組蛋白修飾，該調控方式最近在蜜蜂[60]和家蠶[61]中得到驗證，蜜蜂和家蠶提供了DNA甲基化調控基因表達的直接證據(jù)，也為推動節(jié)肢動物中DNA去甲基化的功能和機制研究奠定了基礎.

DNA去甲基化是DNA甲基化動態(tài)調控不可缺少的一部分，要了解節(jié)肢動物DNA去甲基化如何響應環(huán)境變化，首先要對節(jié)肢動物的DNA甲基化和去甲基化機制有更完整的認知.DNA甲基轉移酶是合成和維持DNA甲基化的關鍵因子，對DNA甲基化的動態(tài)調節(jié)至關重要.在昆蟲體內，DNMT1存在率高且與DNA甲基化相關，而DNMT3的缺失率最高且與DNA甲基化缺少相關性，因此節(jié)肢動物在DNA甲基化的合成上還有待探究：是通過非DNMT蛋白所觸發(fā)？還是DNA甲基化不再重新編程而直接由DNMT1維持穩(wěn)定？為了穩(wěn)定DNA甲基化修飾，一方面，可以通過DNA復制稀釋來降低甲基化水平；另一方面，近年來對5hmC和TETs的探究也初步證明節(jié)肢動物可以通過TETs將5mC氧化為5hmC從而降低DNA甲基化水平.然而，TETs是否在節(jié)肢動物中介導了與哺乳動物類似的主動去甲基化尚未明確，這還需要對節(jié)肢動物中TETs的氧化產(chǎn)物（5fC和5caC）進行檢測，并且對TETs與DNA糖苷酶的協(xié)同作用進行驗證.

另外，DNA甲基化調控對生物生理功能的作用還有待進一步探究.將研究方向從整個組織轉向發(fā)生顯著變化的細胞或基因中，或許能提供更多DNA甲基化調控的線索.通過改變DNA甲基化的水平并分析其導致的相應后果，可以獲得DNA甲基化特定作用的直接證據(jù).RNA干擾技術和抑制劑（如DNA甲基化抑制劑5-azacytidine、DNA去甲基化抑制劑DMOG以及zebularine等）常被用于探究DNA甲基化調控功能的實驗中，但這兩種方法在作用程度以及特異性上仍存在限制.CRISPR技術也常被用于特定基因的功能分析且具有更好的準確性，近年來開發(fā)的一種基于CRISPR-Cas9的特異性DNA甲基化工具[62]為深入了解特定基因中甲基化的功能提供了技術支持，如利用dCas9-Tet1或-Dnmt3a融合蛋白靶向特定基因啟動子區(qū)的去甲基化或甲基化，以觀察該基因表達的變化[63].

DNA去甲基化在節(jié)肢動物中的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但依然存在許多疑問，而這些疑問也為未來更好地研究DNA甲基化以及去甲基化的作用提供了方向和線索.