2021年雞新城疫抗體水平測定國賽各環(huán)節(jié)技術(shù)分析及參賽體會

張 潔,李亞蘭,潘浩浩,張青青

(甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

職業(yè)技能大賽既是衡量辦學(xué)質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是展示師生風(fēng)采的良好平臺。高等職業(yè)院校通過“以賽促教、以賽促學(xué)”，不斷深化教育教學(xué)改革、促進(jìn)校企合作、推進(jìn)產(chǎn)教融合，提高學(xué)生的實踐技能、綜合素質(zhì)和創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力，力求向社會輸出符合市場需求的高素質(zhì)人才。

現(xiàn)將2018年和2021年“雞新城疫抗體水平測定”賽項考核內(nèi)容對比如下表：

表1 2018年和2021年雞新城疫抗體水平測定國賽賽項考核內(nèi)容對比

2021年賽項規(guī)程較2018年加入了理論考核，更接近生產(chǎn)，要求學(xué)生懂得為什么這么做，對于2021年新加入的結(jié)果分析部分，規(guī)程未給出標(biāo)準(zhǔn)答案，兩年的測定方法均以《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)為標(biāo)準(zhǔn)。此賽項技能考核共涉及59個評分要點，操作細(xì)節(jié)決定競賽的優(yōu)劣，筆者以2021年賽項規(guī)程為例，總結(jié)參賽經(jīng)驗，希望能拋磚引玉，與更多同行共同探討、互相學(xué)習(xí)。

1 試驗器材準(zhǔn)備

1.1 儀器與材料準(zhǔn)備

1.1.1 儀器與材料 選取大賽組委會提供賽項所需材料和儀器共計34項，在參賽過程中以“使用合理的前提下夠用”為原則檢查清點。34項中不選擇的干擾項為10 mL禽用采血器和1.5mL指型離心管兩項。96孔V型血凝反應(yīng)板一般4塊夠用，1塊用于血凝試驗，3塊用于血凝抑制試驗；5 mL禽用采血器一般1支夠用，采血需一針見血；15 mL具蓋塑料離心管一般2支夠用，用于紅細(xì)胞洗滌；進(jìn)入實驗室后先檢查滅菌橡膠外科手套的氣密性并正確佩戴，完成采血后更換手套進(jìn)行后續(xù)試驗操作；移液器吸取紅細(xì)胞泥時采用反向移液，吸取其余液體時均采用正向移液。

1.1.2 儀器檢查 微型振蕩器檢查,連接電源，振幅旋鈕調(diào)至最小位置后打開電源，順時針將振幅旋鈕由小調(diào)大，感受振幅強度，再由最大調(diào)至最小，關(guān)閉電源，檢查微型振蕩器是否能正常使用。

離心機(jī)檢查：開蓋檢查離心機(jī)內(nèi)是否有套管，無異物，連接電源后設(shè)置離心機(jī)參數(shù)2 000 r/min，打開開關(guān)試轉(zhuǎn)預(yù)熱1～3 min，檢查離心機(jī)是否能正常使用。

天平配平：以防所提供50 mL燒杯質(zhì)量差異大，可粗配后再標(biāo)記燒杯，在天平的配平過程中，游碼應(yīng)始終在標(biāo)尺左端的零刻線處，將兩個小燒杯口分別朝向天平外側(cè)置于托盤中心位置，通過調(diào)節(jié)平衡螺母使天平平衡，不用時天平應(yīng)處于休止?fàn)顟B(tài)。

1.2 物品標(biāo)識

對使用物品進(jìn)行如下表。

表2 物品標(biāo)識注意事項

1.3 桌面整潔度

實驗器材的擺放需嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)域和潔凈區(qū)域，為避免相互干擾，兩區(qū)域的物品在擺放完畢后盡可能不要來回挪動。

2 配制1%雞紅細(xì)胞懸液

主要考察參賽選手采血方法和采血量是否恰當(dāng)、離心機(jī)使用是否規(guī)范、紅細(xì)胞懸液配制方法是否得當(dāng)?shù)取?/p>

2.1 采血方法和采血量

采血過程由2位參賽者配合完成，采血時盡量做到一針見血。抓雞要遵循“輕、穩(wěn)、準(zhǔn)、巧”的原則，雞抓出雞籠后，助手一手抓住雞小腿，控制好跗關(guān)節(jié)，另一手使雞翅扇形張開，將雞側(cè)臥保定于雞籠上方，雞胸部朝向采血者。采血者用酒精棉球由內(nèi)向外順時針或逆時針方向消毒采血部位，再用干棉球擦干，用拇指壓住翅根靜脈近心端至其怒張，用已吸入0.7 mL 3.8%枸櫞酸鈉的5 mL禽用采血器針頭斜面朝上，由翼根向翅方向從血管側(cè)面刺穿挑起皮膚后再刺入血管壁，見回血，放松近心端按壓，緩慢吸取血液至3.5 mL刻線處。采血者一手用干棉球按壓進(jìn)針處，另一手將針管稍向后退后快速拔針，可避免血液滴出。助手按壓5 min止血后將雞放回籠中，采血者迅速蓋上采血器針帽，將采血器稍向后抽，輕柔地上下混勻后置于試管架，防止血液凝固。完成采血后，助手和采血者均需更換乳膠手套。

2.2 離心機(jī)使用

儀器準(zhǔn)備時已檢查離心機(jī)可正常運轉(zhuǎn)。離心管中液體最多為12 mL。調(diào)平時，離心管(包括管蓋)連同離心管套一起置于已配平好的小燒杯(50 mL)中配平，然后對稱放入離心機(jī)，離心參數(shù)設(shè)定2 000 r/min，離心時間和次數(shù)視紅細(xì)胞洗滌情況而定，一般離心4次，前3次均離心5 min，第4次離心8 min。第1次離心后要盡量棄凈白細(xì)胞層和血小板層。每次吸取完白細(xì)胞層和血小板層，加入生理鹽水后均需搖勻再配平離心，加入生理鹽水后血液管總重應(yīng)大于用于配平的生理鹽水管，配平時僅需向生理鹽水管中加生理鹽水，避免血液管溶血。離心機(jī)運轉(zhuǎn)期間需有人看守，避免異常出現(xiàn)，使用完畢后，將設(shè)置時間和轉(zhuǎn)速均調(diào)至最小，關(guān)閉開關(guān)，切斷電源，并整理電線。

2.3 紅細(xì)胞懸液配制方法

最后一次離心結(jié)束后吸出上清液時可在紅細(xì)胞泥上方留0.5 cm高度的生理鹽水用于壓實紅細(xì)胞泥，吸取紅細(xì)胞泥時用將量程0.1～1 mL的微量移液器調(diào)至150 μL，采用反向移液吸取150 μL紅細(xì)胞泥，分多次均勻打入已準(zhǔn)備好的14.85 mL生理鹽水中，燒杯底貼試驗臺輕輕搖勻，配制好15 mL 1%雞紅細(xì)胞懸液。1%雞紅細(xì)胞懸液制備的優(yōu)劣很大程度決定了試驗進(jìn)度和結(jié)果。

3 血凝(HA)試驗

血凝試驗做3重復(fù)。移液器采用正向移液的方式垂直將樣品加在96孔V型血凝反應(yīng)板底部。標(biāo)準(zhǔn)抗原倍比稀釋時用移液器第一檔在液面下混勻后排空吸頭，再重新吸取一定體積液體放至下一孔。每行抗原倍比稀釋后需更換槍頭。為避免各孔間相互污染，生理鹽水和1%雞紅細(xì)胞懸液應(yīng)由后往前懸滴加入。為保證每孔加入液體濃度一致，標(biāo)準(zhǔn)抗原在吸取前充分混勻，1%雞紅細(xì)胞懸液邊搖邊加。試驗結(jié)果應(yīng)在12孔空白對照紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉于V型板孔底時及時判定。

4 配制四單位病毒

4HAU(Hemagglutinating Unit，四單位病毒)是標(biāo)準(zhǔn)抗原和生理鹽水按比例配制而來，賽項規(guī)定配制10～20 mL 4HAU，以配制12.8 mL 4HAU為例，配制比例如表3。

表3 4HAU配制比例

配制4HAU時先用移液器吸取生理鹽水至50 mL小燒杯內(nèi)，再吸取標(biāo)準(zhǔn)抗原，反復(fù)吹洗多次，充分混勻到生理鹽水內(nèi)。4HAU濃度的準(zhǔn)確性用回滴實驗校正，2021年雞新城疫抗體水平測定賽項參照GB/T16550—2008，未要求回滴實驗，但2020年開始實施的GB/T16550—2020明確給出了4HAU的檢測方法。

5 血凝抑制(HI)實驗

為確保每孔的加樣量和濃度一致，4HAU和1%雞紅細(xì)胞懸液由后往前邊搖勻邊懸滴加入，血清使用前用移液器吹打混勻，倍比稀釋時在同一位置垂直緩慢吹打3～5次，避免產(chǎn)生氣泡。加完4HAU后，用微型震蕩器震蕩15 s，感作30 min。加完1%紅細(xì)胞懸液震蕩后，試驗結(jié)果應(yīng)在12孔空白對照紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉于V型板孔底，且陰陽性對照成立時及時判定。等待血凝抑制試驗結(jié)果時可將儀器和器皿復(fù)位，將生理鹽水配平管中的生理鹽水倒入液廢缸，生理鹽水離心管、采血器、剩余的紅細(xì)胞泥離心管等均放入固廢缸，保證實驗場地整潔。

6 抗體滴度報告

報告單主要包含：血凝試驗的血凝價，血凝抑制試驗4HAU的稀釋度和待檢血清的抗體滴度，用log2表示血凝價和抗體滴度，若抗體效價為10log2，應(yīng)寫為≥10log2。清晰填寫抗體滴度報告，不亂涂亂改。

7 結(jié)果分析

以2021年雞新城疫抗體水平測定賽項規(guī)程為例，結(jié)果分析占實驗總成績的5%，這是2018年賽項規(guī)程所沒有的。結(jié)果分析包含三部分內(nèi)容：血凝抑制試驗陽性(≥4log2)；個體免疫合格(≥5log2)；群體免疫合格率(個體免疫合格數(shù)目/樣品總數(shù))≥70%則群體免疫合格，無需補免；群體免疫合格率<70%則群體免疫不合格，需要補免。若樣本取自免疫雞群，造成這種結(jié)果的原因有兩方面，其一，若免后時間小于兩周，很大的可能是在抗體水平?jīng)]上去的時候感染了野毒，需要隔離并緊急接種。其二，若免后時間大于兩周，很有可能是免疫失敗，需選擇合適的時間采取補免；若樣本取自非免疫雞群，需隔離消毒，用四倍量的四系弱毒苗緊急免疫。

“以賽促教、以賽促學(xué)”的教學(xué)理念促進(jìn)高等職業(yè)教育教學(xué)模式的不斷深化改革。在教師層面，改變了教師傳統(tǒng)的教學(xué)觀念，增強了教師理論與實踐深度融合的能力。在學(xué)生層面，提升了學(xué)生的專業(yè)實踐能力、職業(yè)素養(yǎng)和處理實際生產(chǎn)問題的能力。與此同時，備賽過程促進(jìn)各高等職業(yè)院校畜牧獸醫(yī)類專業(yè)的深層交流，為課程改革乃至專業(yè)建設(shè)帶來新視角、新方向。