有機(jī)添加物對(duì)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的影響

王仕英　陳　煣

有機(jī)添加物對(duì)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的影響

王仕英陳煣

（阿壩師范學(xué)院四川阿壩623000）

文章以軟棗獼猴桃莖尖為外植體，MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L為芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基，1/2MS+IBA 0.4 mg/L為生根培養(yǎng)基，分別添加不同濃度香蕉泥或椰汁，以不添加有機(jī)添加物為空白對(duì)照，探究香蕉泥和椰汁對(duì)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：軟棗獼猴桃莖尖組織培養(yǎng)中，添加有機(jī)添加物能夠有效促進(jìn)植物組織芽分化、增殖及生根；添加100 g/L香蕉泥更有利于誘導(dǎo)芽分化，添加150 g/L香蕉泥或150 mL/L椰汁更有利于增殖，添加100 g/L香蕉泥更有利于生根及根系生長(zhǎng)。

軟棗獼猴桃；組織培養(yǎng)；香蕉泥；椰汁

軟棗獼猴桃又稱軟棗子、藤梨等，為獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物，在我國(guó)南北方均可栽培，既可作為果蔬資源，又可用于園林庭院綠化。研究表明，軟棗獼猴桃為藥食兩用水果，不僅含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有蒽醌類、多糖類及多酚類等藥理活性成分，具有抗炎、抗氧化活性[1-4]。隨著人們生活水平的提高和對(duì)天然健康食品的追求，由軟棗獼猴桃開發(fā)出的產(chǎn)品越來越多，如軟棗獼猴桃果醬、飲料、果脯等[5]。由此可見，軟棗獼猴桃的市場(chǎng)前景較為廣闊。

依賴于其適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前我國(guó)已開始規(guī)?；N植軟棗獼猴桃，特別是在東北三省。軟棗獼猴桃的繁殖方式以播種、嫁接及扦插為主，由于其繁殖受季節(jié)、氣候等因素的影響較大，因此各國(guó)利用組織培養(yǎng)方式進(jìn)行繁殖育種由來已久[6]。在我國(guó)，軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)研究可以追溯到1991年，張喜春等以軟棗獼猴桃葉片為試材，成功誘導(dǎo)出適合于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織[7]。1992年，胡桂珍等以軟棗獼猴桃的胚為組織培養(yǎng)外植體，成功獲得再生植株[8]；2008年，鄭小華等通過對(duì)軟棗獼猴桃莖、葉離體培養(yǎng)的探索，極大地促進(jìn)育苗效率[9-10]；2018年，李強(qiáng)通過對(duì)“龍成2號(hào)”軟棗獼猴桃組培體系的探索，得到了最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基配方[11]。

目前對(duì)于軟棗獼猴桃的組織培養(yǎng)，完全依賴化學(xué)添加劑，但在其他物種中成熟的實(shí)踐表明，相比化學(xué)添加劑，簡(jiǎn)便易得的有機(jī)添加物同樣能夠增強(qiáng)植物組織培養(yǎng)中外植體的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)，促進(jìn)植物組織增殖及存活。目前植物組織培養(yǎng)中較常使用的有機(jī)添加物有椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等，已廣泛應(yīng)用于蝴蝶蘭、鐵皮石斛等珍貴物種的組織培養(yǎng)中[12-13]。本研究選取椰汁和香蕉泥作為有機(jī)添加物，探索其在組織培養(yǎng)的不同階段對(duì)軟棗獼猴桃生長(zhǎng)的影響，以期找到一種適合軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的有機(jī)添加物，加快軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)速度，為軟棗獼猴桃種苗規(guī)?；S化繁殖提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

軟棗獼猴桃植株選用自花授粉品種“庫庫瓦”，購自虹越官方店，2020年3月選擇當(dāng)年生帶芽幼嫩莖條作為試驗(yàn)材料。

1.2 外植體消毒

試驗(yàn)前取長(zhǎng)勢(shì)相同的帶腋芽幼嫩莖段，放置于燒杯中，并用紗布封口，置于自來水下流水沖洗2 h，沖洗完畢后轉(zhuǎn)移至提前消毒的超凈工作臺(tái)，用75%乙醇消毒10 s，無菌水清洗后置于無菌濾紙上吸干水分，繼而置于三角瓶中用0.15%氯化汞溶液浸泡7 min～8 min，其間不斷搖晃以使外植體充分接觸氯化汞，保證消毒效果。最后用無菌水沖洗4次～5次，將消毒后的外植體置于滅菌的培養(yǎng)皿中濾紙上，切成長(zhǎng)約2 cm的帶芽莖段，便于之后接種于待測(cè)培養(yǎng)基中。

1.3 供試培養(yǎng)基配制

通過查閱資料，芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MS+6-BA2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)基選擇MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根培養(yǎng)基選擇1/2MS+IBA 0.4 mg/L[11]。選擇椰汁及香蕉泥作為有機(jī)添加物，其中香蕉泥通過市售香蕉去皮勻漿過濾制得。將兩種有機(jī)添加物分別添加至3種培養(yǎng)基中，空白對(duì)照（CK）為不添加兩種有添加機(jī)物的培養(yǎng)基，各處理組有機(jī)添加物添加濃度如表1所示。培養(yǎng)基配制完成后調(diào)節(jié)pH至6，121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌15 min，靜置冷卻后用于外植體接種。

表1培養(yǎng)基中有機(jī)添加物的添加濃度設(shè)置

編號(hào)有機(jī)添加物添加濃度/mL/L編號(hào)有機(jī)添加物添加濃度/g/L A1椰汁50B1香蕉泥50 A2椰汁100B2香蕉泥100 A3椰汁150B3香蕉泥150 A4椰汁200B4香蕉泥200 CK無————

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將經(jīng)過消毒的外植體在超凈工作臺(tái)中于無菌條件下接種于含有不同有機(jī)添加物的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種6瓶共計(jì)30個(gè)外植體，于光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間14 h/d，溫度（25±1）℃下培養(yǎng)25 d后觀察腋芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)及褐化情況，篩選最適宜的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.5 增殖培養(yǎng)

將芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至一定長(zhǎng)度的腋芽從莖端基部剪下，剪成1.5 cm左右一芽一段，轉(zhuǎn)接于含有不同有機(jī)添加物的增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)～4個(gè)芽段，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種3瓶，30 d后觀察幼苗生長(zhǎng)情況，篩選最適宜的增殖培養(yǎng)基。

1.6 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)健壯的幼嫩無根苗轉(zhuǎn)移至添加不同有機(jī)添加物的生根培養(yǎng)基中，每瓶接種無根苗2個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種3瓶，25 d后觀察生根情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel、Origin 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)添加物對(duì)軟棗獼猴桃組培芽分化誘導(dǎo)的影響

添加不同有機(jī)添加物的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體褐化數(shù)及分化數(shù)如圖1所示。

圖1　不同芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體褐化率及分化率

外植體在芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第10天時(shí)腋芽開始萌動(dòng)，由圖1可以看出，所有芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基都能在一定程度上誘導(dǎo)腋芽分化，但誘導(dǎo)效果存在差異。A3、B2、B3培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果顯著高于其他組，其中B2誘導(dǎo)分化率最高，達(dá)到93.3%。不同種類及添加濃度的有機(jī)添加物對(duì)芽分化誘導(dǎo)過程中褐化率的影響同樣存在差異，添加200 g/L香蕉泥的B4培養(yǎng)基褐化率最高，其次為B3、A4培養(yǎng)基，其他組培養(yǎng)基對(duì)芽分化誘導(dǎo)過程中的褐化率沒有顯著影響，分析原因可能為培養(yǎng)基中含量過高的糖類等營(yíng)養(yǎng)成分提高了多酚氧化酶活性，導(dǎo)致褐化率增大。

2.2 不同有機(jī)添加物對(duì)腋芽增殖及生長(zhǎng)情況的影響

添加不同有機(jī)添加物的增殖培養(yǎng)基上腋芽增殖及生長(zhǎng)情況如圖2、圖3、圖4所示。

圖2　不同增殖培養(yǎng)基中組培苗平均株高和葉片數(shù)

圖3　不同增殖培養(yǎng)基中組培苗的增殖系數(shù)

圖4　軟棗獼猴桃組培苗增殖情況

由圖2可知，不同有機(jī)添加物均可在一定程度上促進(jìn)腋芽增殖和生長(zhǎng)，與CK組相比，添加香蕉泥或椰汁的增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的組培苗在株高和葉片數(shù)上有顯著優(yōu)勢(shì)。由圖4可知，A3、B3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的組培苗，其株高、葉片數(shù)以及生長(zhǎng)旺盛程度要明顯優(yōu)于CK組，說明香蕉泥和椰汁所含有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分及礦物質(zhì)等均可被軟棗獼猴桃組培苗有效吸收。圖3為不同增殖培養(yǎng)基中組培苗的增殖系數(shù)，可知添加有機(jī)添加物的增殖培養(yǎng)基的增殖系數(shù)顯著高于CK組。其中添加150 g/L香蕉泥的B3組增殖系數(shù)最高，達(dá)到4.89，其次為添加150 mL/L椰汁的A3組，增殖系數(shù)為4.79，與其他組有顯著差異，且此兩組的平均株高及葉片數(shù)均顯著高于其他組。綜合分析A3、B3組，添加150 g/L香蕉泥或150 mL/L椰汁促進(jìn)腋芽增殖的效果最好，兩組的平均株高、平均葉片數(shù)和增殖系數(shù)沒有顯著差異，說明在適宜添加濃度下，香蕉泥與椰汁對(duì)軟棗獼猴桃組培苗營(yíng)養(yǎng)成分的供應(yīng)是相似的，但隨著有機(jī)添加物添加濃度繼續(xù)增大，組培苗生長(zhǎng)情況和增殖系數(shù)反而急劇下降，可能是由于養(yǎng)分過剩導(dǎo)致鹽害，從而影響組培苗生長(zhǎng)。

2.3 不同有機(jī)添加物對(duì)組培苗生根情況的影響

添加不同有機(jī)添加物的生根培養(yǎng)基上組培苗生根情況如圖5、圖6所示。

圖5　不同生根培養(yǎng)基中組培苗平均根長(zhǎng)和根數(shù)

圖6　軟棗獼猴桃組培苗生根情況

由圖5可知，添加不同種類及含量有機(jī)添加物的生根培養(yǎng)基中組培苗的生根效果明顯優(yōu)于對(duì)照組，其中表現(xiàn)較好的兩組培養(yǎng)基為A2和B2，特別是B2培養(yǎng)基，組培苗平均根長(zhǎng)可達(dá)到1.81 cm，平均根數(shù)可達(dá)到5.32根。A2培養(yǎng)基平均根長(zhǎng)為1.70 cm，平均根數(shù)為4.59，生根率達(dá)到100%。并且包括CK在內(nèi)，所有生根培養(yǎng)基在不同時(shí)間內(nèi)均可使組培苗生根。圖6為將組培苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基后第15天的生根情況，由圖6可知，未添加任何有機(jī)添加物的對(duì)照組在第15天時(shí)只有部分須根及氣生根長(zhǎng)出，而添加香蕉泥或椰汁的試驗(yàn)組第15天時(shí)均有粗壯的主根長(zhǎng)出，特別是添加100 g/L香蕉泥的B2組，第15天時(shí)根系生長(zhǎng)已初步完善，主根和須根的根長(zhǎng)以及數(shù)量均高于其他組。

3 討論與結(jié)論

本研究以軟棗獼猴桃品種“庫庫瓦”的幼嫩莖段為外植體，研究有機(jī)添加物香蕉泥和椰汁對(duì)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)不同階段的影響。試驗(yàn)選擇不同添加濃度的兩種有機(jī)添加物，通過統(tǒng)計(jì)在腋芽誘導(dǎo)階段的誘導(dǎo)分化率及褐化率，增殖階段的生長(zhǎng)情況和增殖系數(shù)以及生根情況等相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，綜合表明有機(jī)添加物在一定程度上可以促進(jìn)植物組織培養(yǎng)過程中的芽分化、增殖和生根。這與李揚(yáng)等在有機(jī)添加物對(duì)馬鈴薯組培苗生長(zhǎng)中的影響研究中所得出的結(jié)論一致[14]。在芽分化誘導(dǎo)階段，隨著培養(yǎng)基中兩種有機(jī)添加物含量升高，外植體褐化率有升高趨勢(shì)，這可能是由于培養(yǎng)基中含量過高的糖等營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)加劇褐化[15]。同樣的抑制作用也體現(xiàn)在腋芽增殖及生根階段。從試驗(yàn)結(jié)果可知，不同添加濃度的兩種有機(jī)添加物均對(duì)組培苗增殖及生根均有促進(jìn)作用，但超過適宜濃度后，隨有機(jī)添加物添加濃度的持續(xù)增加，其促進(jìn)作用會(huì)降低，說明組織培養(yǎng)過程中組培苗對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收是有限度的，過量添加有機(jī)物并不能持續(xù)促進(jìn)其生長(zhǎng)。

該研究結(jié)果表明，最適宜軟棗獼猴桃外植體芽分化誘導(dǎo)的添加有機(jī)添加物培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L+香蕉泥100 g/L，最適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+香蕉泥150 g/L，或MS+6-BA2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+椰汁150 mL/L，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+香蕉泥100 g/L。香蕉泥、椰汁等均為易得的有機(jī)添加物，其中含有復(fù)合營(yíng)養(yǎng)成分，如無機(jī)物、有機(jī)物、生長(zhǎng)離子等，任何一種成分都可能是影響植物組織培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素，鑒于其價(jià)格低廉、易得的特點(diǎn)，尋找合適高效的組織培養(yǎng)有機(jī)添加物或其組合，有利于提高生產(chǎn)效率，降低組織培養(yǎng)育苗成本。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.09.03

S663.4

A

2095-1205(2022)09-07-04

阿壩師范學(xué)院校級(jí)規(guī)劃項(xiàng)目（ASB19-16）；四川省教育廳2021—2023年高等教育人才培養(yǎng)質(zhì)量和教學(xué)改革項(xiàng)目（JG2021- 118）；阿壩師范學(xué)院2019年實(shí)踐教學(xué)類綜合改革項(xiàng)目（201904028）

王仕英（1989- ），女，漢族，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)。