脂多糖誘導的肝衰竭中巨噬細胞能量代謝變化

郭金 石春霞 鄧威 張璐懿 陳倩 龔作炯

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)伴有肝細胞大量凋亡或壞死，病死率高達80%～90%[1]。肝臟作為能量代謝的中心，ALF患者常合并能量代謝紊亂，肝功能衰竭時固有免疫細胞線粒體氧化磷酸化受抑，糖酵解加速的現(xiàn)象[2]。蘋果酸脫氫酶1(malate dehydrogenase 1，MDH1)在胞質中通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)催化蘋果酸-天冬氨酸穿梭(malate-aspartate shuttle，MAS)，MAS主要將位于線粒體內(nèi)膜的NADH，通過蘋果酸轉運進入線粒體基質，參與線粒體氧化呼吸，生產(chǎn)ATP[3, 4]，因此MDH1對于調節(jié)細胞胞質和線粒體能量代謝有著重要意義[5]。目前對于MDH1和代謝關聯(lián)的研究主要集中于腫瘤方面，其在ALF時的水平變化和作用有待深入探討。肝衰竭過程中肝組織依次經(jīng)受免疫損傷、缺血缺氧損傷、內(nèi)毒素血癥三重打擊，其中，腸源性內(nèi)毒素血癥可以激活巨噬細胞釋放多種細胞因子[6]。越來越多的研究報道了炎癥與能量代謝的緊密關聯(lián)，故本研究檢測了蘋果酸脫氫酶底物及產(chǎn)物在ALF患者中的變化，并使用LPS，革蘭陰性菌胞壁成分[7]，處理小鼠ANA-1巨噬細胞，比較對照組及LPS處理組TNF-α、MDH1、乳酸、葡萄糖、ATP水平，以揭示LPS對巨噬細胞能量代謝的影響，為改善肝衰竭預后提供可能的治療策略。

材料與方法

一、一般資料

收集2019年10月至2019年11月于武漢大學人民醫(yī)院就診的16例研究對象血清，其中正常體檢者8例，男性5例，女性3例，年齡(47.5±12.6)歲；急性肝衰竭者8例，男性5例，女性3例，年齡(42.5±14.0)歲。兩組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、納入與排除標準

ALF患者診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》[8]，排除合并慢性肝炎等肝病病史者，排除合并有惡性腫瘤(如肝癌等)以及心、肺、腎等重要臟器器質性病變者。本研究經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準通過(WDRY2021-K016)，所有研究對象均簽署知情同意書。

三、材料與試劑

小鼠ANA-1巨噬細胞購自武漢大學細胞保藏中心，LPS購自美國 Sigma- Aldrich 公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰酶購自合肥Biosharp公司，小鼠MDH1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自上海江萊生物科技，小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技，ATP及乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，葡萄糖檢測試劑盒購自北京索萊寶科技，MDH1一抗、GAPDH一抗購自武漢三鷹公司，BCA蛋白定量試劑盒購自武漢碧云天公司。

四、方法

(一)血清生化指標收集 收集研究對象臨床生化指標，包括：活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，Alb)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBil)。

(二)LC-MS檢測血清草酰乙酸和蘋果酸水平 血清4℃復融，每份樣本取100 μL，加入100 μL預冷去離子水+800 μL預冷甲醇/乙腈+800 μL內(nèi)標Succinate-d6和Alanine-d4混勻，冰浴中超聲 60 min，-20℃ 孵育1 h沉淀蛋白，14 000×g 4℃ 離心 20 min，取上清。采用Shimadzu Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜進行分離，柱溫40℃，流速300 μL/min，進樣5 μL，0～1 min，95%B；1～12 min, 95%～55%B；12～13 min，55%～40%B；13～15 min，40%B；15～15.1 min，40%～95%B ；15.1～18 min，95%B。使用QTRAP5500質譜儀(AB SCIEX)，配置電噴霧離子源( ESI) ，負離子模式，氣簾氣壓力 35 kPa，電噴霧電壓-4500 V，離子源溫度 550 ℃，輔助氣1壓力 40 kPa，輔助氣2壓力 50 kPa，檢測正常組和ALF組血清草酰乙酸和蘋果酸水平。

(三)細胞培養(yǎng) ANA-1細胞為小鼠巨噬細胞，采用含10%胎牛血清+1%鏈-青霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃ 體積分數(shù)為0.05的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長情況，取對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

(四)構建LPS誘導的ANA-1巨噬細胞模型 取對數(shù)期生長的ANA-1細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，分為對照和LPS兩組，待細胞密度達500(萬個/皿)時，對照組使用DMEM培養(yǎng)基，不加用藥物處理；LPS組使用含5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基。孵育24 h后收集細胞及上清，檢測ANA-1細胞內(nèi)MDH1、乳酸、葡萄糖、ATP含量以及上清中TNF-α水平。

(五)檢測細胞上清TNF-α水平 收集細胞上清，采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測TNF-α，酶標儀450 nm波長處測定A值，繪制曲線計算樣本濃度。

(六)檢測細胞內(nèi)MDH1水平 收集細胞，用PBS稀釋細胞懸液，通過反復凍融破壞細胞并釋放細胞內(nèi)成分，4℃離心(2500 r/min，20 min)后收集上清，采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MDH1水平，酶標儀450 nm波長處測定A值，繪制曲線計算樣本濃度。

(七)蛋白質印跡檢測細胞內(nèi)MDH1蛋白含量 將每組細胞胰酶消化后置于4 mL EP管內(nèi)，使用超聲碎膜儀進行處理后，提取總蛋白，BCA 定量試劑盒測定蛋白含量。加樣30 μg/每孔，電泳后進行轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫下避光孵育1 h，洗膜后使用Odyssey系統(tǒng)掃描分析。檢測兩組細胞內(nèi)MDH1蛋白含量。

(八)檢測細胞內(nèi)乳酸、葡萄糖、ATP水平 收集細胞，使用相應試劑盒，嚴格按照說明書加入檢測樣本及試劑，酶標儀(波長：葡萄糖505 nm、乳酸630 nm、ATP636 nm)測定A值，計算相應樣本濃度。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩組血清生化指標比較

正常體檢組和肝衰竭組血清APTT、PTA、ALT、AST、Alb、TBil、DBil差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清生化指標比較(±s)

二、血清草酰乙酸和蘋果酸水平

與正常組相比，ALF組血清蘋果酸增多為(11.973±3.236)比(22.674±7.210)，草酰乙酸減少為(0.722±0.230)比(0.420±0.084)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.830、-3.486，P=0.004)。

三、細胞上清液TNF-α水平

與對照組(255.010±16.139)pg/mL相比，LPS處理組細胞上清液中TNF-α水平升高(1722.501±76.261)pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(t=26.624，P<0.05)。

四、細胞內(nèi)MDH1水平與蛋白含量

與對照組(15.710±0.302)ng/mL相比，LPS處理組細胞內(nèi)MDH1水平降低(11.831±0.335)ng/mL，同時，細胞內(nèi)MDH1蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=-12.172，P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組細胞內(nèi)MDH1蛋白含量條帶圖

五、細胞內(nèi)乳酸、葡萄糖、ATP水平

與對照組相比，LPS組細胞內(nèi)乳酸及葡萄糖水平升高，ATP水平減低(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞內(nèi)乳酸、葡萄糖及ATP水平比較(±s)

討 論

肝臟在氨基酸、脂肪酸、碳水化合物等的代謝中起著核心作用，有研究分析了慢加急性肝衰竭患者血清代謝組學，證明肝衰竭時線粒體相關的能量代謝受抑制[2]。

介導蘋果酸和草酰乙酸這兩種物質相互轉化的酶主要是蘋果酸脫氫酶，它是參與有氧呼吸的重要代謝酶。蘋果酸脫氫酶1位于胞質，參與MAS，伴有NAD+生成，以支持線粒體氧化磷酸化[9]。本研究結果提示ALF患者血清蘋果酸增多，草酰乙酸減少，可能是由于肝衰竭時各種原因導致線粒體膜結構破壞，三羧酸循環(huán)障礙，蘋果酸脫氫酶底物蘋果酸蓄積，產(chǎn)物草酰乙酸生成減少[10]。

巨噬細胞是生物體抵抗病原感染、激活炎癥反應的重要元件，可以迅速適應各種微環(huán)境刺激并迅速對其作出反應，在不同的刺激條件下分化為M1/M2(促炎/抗炎)兩種表型，M2型主要抵御寄生蟲感染，可促進組織修復及傷口愈合，其能量代謝以脂肪酸氧化以及氧化磷酸化為主[11]。而LPS可以激活巨噬細胞中多種信號通路(促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB等)，促進TNF-α、白介素-1β等細胞因子釋放[12]，此為M1型巨噬細胞。He等[13]的研究表明，LPS激活Toll樣受體4誘導小鼠腹腔巨噬細胞壞死，能量代謝紊亂。LPS處理的巨噬細胞哺乳動物雷帕霉素靶點激活，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達增加；誘導型一氧化氮合酶表達增加，生產(chǎn)NO抑制線粒體呼吸[14,15]。可見，LPS誘導M1型巨噬細胞三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化受阻[16]。TNF-α屬于TNF超家族，參與炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡等過程[17]。在本研究中，LPS觸發(fā)的促炎反應是模擬肝衰竭時內(nèi)毒素血癥激活巨噬細胞釋放細胞因子。LPS處理組上清液中TNF-α明顯升高，表明所誘導的巨噬細胞活化并釋放了炎癥因子。

本研究檢測了ANA-1細胞內(nèi)MDH1水平和蛋白含量，結果均提示MDH1活性減低。有研究表明，線粒體功能障礙時，MAS受損，相關酶活性降低。胞內(nèi)MDH1水平的減低可能與細胞損傷后線粒體相關能量代謝受抑，以及胞膜破壞后酶釋放至胞外有關[18]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，LPS處理組ANA-1細胞乳酸增加，可能來源于線粒體氧化呼吸異常后代償性糖酵解加速，同時，HIF-1α表達上調可以誘導乳酸脫氫酶表達，催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸[14]。ATP作為生物體能量利用的基本形式，其水平反映了細胞代謝活力，耗竭時可致細胞凋亡或壞死[5]。由于糖酵解途徑產(chǎn)生ATP效率相對低下[19]，故當巨噬細胞受到LPS刺激時，ATP生成減少，本實驗中也觀察到了LPS組ATP減少的現(xiàn)象。此外，LPS組胞內(nèi)葡萄糖含量增加，因為線粒體功能障礙時，葡萄糖消耗減少，同時，代謝活躍的免疫細胞可加速攝取葡萄糖至胞內(nèi)，導致細胞內(nèi)葡萄糖濃度升高[20, 21]。Nishikawa等[22]發(fā)現(xiàn)，肝硬化失代償期的小鼠肝細胞線粒體功能障礙，耗氧率減低，ATP生成明顯減少，葡萄糖消耗減少，乳酸生成增加，與本研究結果一致。

Xu等[23]研究表明，卡格列凈通過抑制小鼠腹腔巨噬細胞糖酵解，可以起到抗炎的作用，此種效應在針對衣康酸的研究中也有所體現(xiàn)[24]。因此，要深刻理解免疫細胞能量代謝與炎癥活性之間的關系，并以此為切入點，改變肝衰竭時能量代謝狀態(tài)，減少肝臟損傷，促進肝功能恢復，改善疾病預后。