復(fù)方丹參注射液對(duì)家兔退變腰椎間盤的TNF-α與CTGF的表達(dá)影響

徐立國(guó)(通訊作者) 楊自兵 徐 杰 孫繼峰

( 日照市中心醫(yī)院 ， 山東 日照 276800 )

椎間盤退行性疾病(Degenerative disc disease DDD)在全球范圍內(nèi)仍然是一個(gè)普遍的折磨人的疾病，對(duì)經(jīng)濟(jì)的影響比較大，并且可導(dǎo)致生活質(zhì)量的下降。背部疼痛與神經(jīng)功能缺損與椎間盤退變相關(guān)。雖然已投入很多的努力來(lái)理解DDD的病因與腰痛的發(fā)病關(guān)系，但進(jìn)展不是很明顯。在上個(gè)世紀(jì)的大部分時(shí)間，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腰椎間盤突出癥的病因主要是由于年齡、性別、職業(yè)、吸煙和暴露于車輛的振動(dòng)等。最近的研究表明，遺傳可能是椎間盤突出癥的主要責(zé)任原因。自1998年以來(lái)，對(duì)于與椎間盤退變的幾個(gè)基因的鑒定表明遺傳的影響已被證實(shí)。現(xiàn)在許多研究人員一致認(rèn)為腰椎間盤突出癥似乎是類似其他的復(fù)雜疾病，其病因有環(huán)境和遺傳的影響。了解椎間盤退變性疾病的病理生理機(jī)制仍然是一個(gè)重要的研究重點(diǎn)，因?yàn)樽甸g盤發(fā)生的年齡相關(guān)性變化與腰痛是緊密聯(lián)系在一起的，并且與其它相關(guān)的神經(jīng)功能缺損亦有聯(lián)系。椎間盤為全身最大的無(wú)血管結(jié)構(gòu)，數(shù)量有限的血管滲透到關(guān)節(jié)軟骨終板的表面區(qū)域和外圍纖維環(huán)的外1/3處。但是沒有血管位于髓核細(xì)胞中[1]。它必需的營(yíng)養(yǎng)包括氧氣和血糖主要是通過(guò)擴(kuò)散方式到達(dá)髓核細(xì)胞，因此構(gòu)成了髓核細(xì)胞中的一個(gè)低氧狀態(tài)和環(huán)境。另外，在椎間盤退化過(guò)程中這種低氧環(huán)境可以通過(guò)軟骨終板通透性的缺失得到加強(qiáng)。在許多疾病過(guò)程中，炎癥為一個(gè)重要的細(xì)胞應(yīng)激伴隨著明顯的病理學(xué)并發(fā)癥，例如腦缺血、癌癥和慢性變性疾病。 TNF-α為一種研究最多的促炎性分子，可以促進(jìn)軟骨聚集蛋白聚糖降解、促進(jìn)分解代謝和促炎性細(xì)胞因子NGF的表達(dá)，沒有任何恢復(fù)。TNF-α為脂肪細(xì)胞因子(adipokine)與牛椎間盤極大數(shù)量的衰老細(xì)胞相聯(lián)系。因此涉及到變性的椎間盤的無(wú)能力通過(guò)自己重新植入。令人好奇的是，雖然許多研究已經(jīng)將研究焦點(diǎn)集中于TNF-α在椎間盤退行性病變中的作用，但Hoyland和其同事建議在退化性椎間盤中TNF-α替換IL-Iβ為基質(zhì)降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子：IL-1在臨床上與慢性腰痛相關(guān)的椎間盤中呈高度表達(dá)，并且對(duì)抗IL-Iβ的治療方法可抑制基質(zhì)降解，IL-1在退變性人類椎間盤中為上調(diào)狀態(tài)，誘導(dǎo)MMPT、MMP13和ADAMTS(解聚素和金屬蛋白酶且伴有凝血酶敏感蛋白圖譜)生成，表明了正常椎間盤自我平衡的反常調(diào)節(jié)。TNF-α阻斷劑對(duì)基質(zhì)降解活性不產(chǎn)生作用，表明它在椎間盤退行性病變中的上調(diào)與基質(zhì)降解沒有關(guān)系，但是附近的神經(jīng)根刺激具有聯(lián)系，這在別的實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)。因此TNF-α可能會(huì)促成椎間盤疼痛，在神經(jīng)內(nèi)向生長(zhǎng)進(jìn)入椎間盤退行性裂縫發(fā)生的案例中。有研究證明，CTGF對(duì)于椎間盤細(xì)胞的合成代謝具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。有研究證明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β經(jīng)由Smad3 /AP - 1通路對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，CTGF在退變骨化椎間盤的表達(dá)明顯高于正常組，但在椎間盤退變中CTGF的作用不是很了解[2]。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤變性與血管生成相關(guān)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子與新生血管的形成關(guān)系非常密切，研究者在對(duì)采集的21個(gè)椎間盤樣本進(jìn)行的形態(tài)學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生退行性病變的椎間盤中，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在病變椎間盤中的表達(dá)水平要高于其在正常椎間盤中的表達(dá)水平，尤其是在椎間盤樣本的新生血管形成區(qū)域，因此研究者認(rèn)為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在某種條件下會(huì)加速椎間盤的退行性病變的發(fā)生速度，椎間盤退行性病變的具體機(jī)制猜測(cè)可能與相關(guān)的新生血管形成具有某種聯(lián)系。本研究觀察復(fù)方丹參注射液對(duì)大鼠退行性椎間盤病變中TNF-ɑ與CTGF的表達(dá)影響。為復(fù)方丹參注射液預(yù)防和治療椎間盤退變和腰椎間盤退行性疾病的分子機(jī)理提供一個(gè)新的理論依據(jù)。報(bào)告如下。

資料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年家兔36只，(由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不拘，體質(zhì)量范圍在2.3-2.8kg。隨機(jī)分為觀察組、模型組、空白組，每組12只。模型組和觀察組每只家兔 L3-4, L4-5椎間盤行針刺手術(shù)，空白組不進(jìn)行手術(shù)干預(yù)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器:(1)PRIM-R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(德國(guó)賀利氏儀器公司)；(2)H2-881S臺(tái)式水浴恒溫震蕩器(太倉(cāng)市科教器材廠)；(3)FA2004電子天平(中國(guó)上海天平廠)；(4)Eppendorf移液器(德國(guó))；(5)BH-2型生物光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)；(6)攝像及FR-988生物顯微圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)；(7)Glanz微波爐(廣東順德加用電器有限公司)：(8)KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；(9)YXQG41780-A型高壓消毒鍋中國(guó)(上海醫(yī)用核子儀器廠)；(10)PC721分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；(11)MDF-330型立式超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；(12)YDS-10液氮生物容器(四川亞西機(jī)器廠)；(13)YL3型回轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海儀表廠)；(14)XY-86型振動(dòng)切片機(jī)(浙江象山科學(xué)精密儀器廠)；(15)202-3型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

3 手術(shù)方法：首先用碘伏對(duì)作業(yè)區(qū)進(jìn)行消毒，然后無(wú)菌手術(shù)洞巾覆蓋作業(yè)區(qū)，手術(shù)的前外側(cè)入路切口大約為6.0cm-8.0cm的長(zhǎng)度(右肋緣下至髂前上棘斜切口)，手術(shù)刀逐層對(duì)皮膚的淺與深筋膜層進(jìn)行分離，并進(jìn)行腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌等肌肉的分離，按照家兔肌肉纖維的方向。沿腹內(nèi)斜肌及腹橫肌之間向后分離肌肉及筋膜，分離至與豎脊肌相搭界的筋膜，縱向剪開，為腹膜前間隙。順著腹膜外間隙剝離，并將肌肉向內(nèi)側(cè)，對(duì)脊柱前的血管、組織等進(jìn)行鈍性分離。鈍性分離腹膜外間隙到腰椎橫突前外側(cè)，第十二肋定位曝光揭示預(yù)穿刺椎間盤對(duì)于椎前階段的血管要進(jìn)行小心仔細(xì)的分離，用直徑為1mm的注射器針頭穿刺所暴露的椎間盤，針頭的穿刺深度大約控制在5mm左右，針頭穿刺到達(dá)制定深度后時(shí)間維持5秒即可撥出穿刺針頭。模型組的每個(gè)椎間盤只常規(guī)穿刺1針。穿刺完成后對(duì)家兔進(jìn)行徹底止血，用碘伏對(duì)手術(shù)視野進(jìn)行2次沖洗，隨后逐層縫合關(guān)閉切口層。觀察組行椎間盤內(nèi)注射復(fù)方丹參注射液 ( 正大青春寶藥業(yè)有限公司 )，每周1次。

4 椎間盤組織樣品制備：用鋒利的刀片將中性甲醛固定液固定的組織作冠狀切片，厚3mm，流水沖洗1小時(shí)(以洗去固定液)，入上行梯度乙醇脫水(50%、70%、80%、95%、95%Ⅱ、100%、100%Ⅱ)各20-30分鐘，二甲苯透明2-3小時(shí)，浸蠟2-3小時(shí)，常規(guī)包埋。組織切片機(jī)切片，厚度為5-6μm，每隔100μm連續(xù)取3張，相鄰切片分為3套。2套分別用于免疫組織化學(xué)法測(cè)定TNF-ɑ和CTGF的表達(dá)，1套用于HE染色。TNF-ɑ和CTGF免疫組織化學(xué)染色測(cè)定按照說(shuō)明書步驟嚴(yán)格執(zhí)行。

5 觀察指標(biāo)：第 4、6、8、12 周時(shí) , 分別處死各組家兔制備椎間盤切片，行組織切片HE染色和免疫組化染色，并對(duì)觀察組、模型組與空白組的椎間盤組織中的TNF-ɑ和CTGF的陽(yáng)性表達(dá)分別進(jìn)行定性、定位與半定量檢測(cè)，并對(duì)TNF-ɑ和CTGF的陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行分析。

7 結(jié)果

7.1 模型組椎間盤鏡下組織學(xué)觀察：第4周鏡下觀察到外周纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯紊亂，并且軟骨終板細(xì)胞的層次分辨不清，組織結(jié)構(gòu)排列較紊亂；第6周鏡下觀察到椎間盤的髓核區(qū)域發(fā)生皺縮，外周纖維環(huán)發(fā)生破裂現(xiàn)象，第8周部分椎間盤的軟骨終板產(chǎn)生鈣化層，軟骨細(xì)胞的數(shù)量呈減少狀態(tài)。第12周鏡下觀察到椎間盤退行性變化非常明顯，部分軟骨終板的鈣化層發(fā)生增厚并產(chǎn)生骨化現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)非常紊亂，大部分的軟骨陷窩呈消失狀態(tài)，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯，并發(fā)生核碎裂、核溶解現(xiàn)象。潮線大部分增厚呈模糊狀態(tài)，與軟骨終板鄰近的髓核變性和纖維化。

7.2 免疫組化染色標(biāo)記：(1)TNF-ɑ表達(dá)結(jié)果。模型組與空白組比較，TNF-ɑ表達(dá)明顯增多；觀察組與模型組比較，觀察組TNF-ɑ表達(dá)明顯減少，模型組TNF-ɑ隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增多，至第12周略微降低，觀察組TNF-ɑ表達(dá)呈比較穩(wěn)定的狀態(tài)。病理學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見表1。(2)CTGF表達(dá)的結(jié)果。模型組與空白組比較，CTGF表達(dá)明顯增多；觀察組與模型組比較，CTGF表達(dá)明顯減少，模型組CTGF隨時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)逐漸增多，觀察組CTGF表達(dá)呈比較穩(wěn)定的狀態(tài)。病理學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見表2。

表1 椎間盤內(nèi) TNF-ɑ 的表達(dá)情況

表2 椎間盤內(nèi) CTGF的表達(dá)情況

討 論

在人類的椎間盤中發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞因子，種類非常多，細(xì)胞因子的種類和數(shù)量依賴于椎間盤是否健康、退化或脫出。某些重要的研究已經(jīng)澄清炎癥因子可在椎間盤的自我平衡狀態(tài)中表達(dá)或退行性病變中表達(dá)。更為重要的是髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、天然椎間盤細(xì)胞(native IVD cells)可生成這些介質(zhì)。值得注意的是在椎間盤脫出(擠出組織、死骨)的患者案例中，椎間盤被其他類型的細(xì)胞侵入。例如腫瘤壞死因子-α在已死去的胎兒/幼兒和老年人成人的髓核細(xì)胞樣本中大量表達(dá)。然而腫瘤壞死因子-α在青年人或年輕成人的髓核細(xì)胞中很少表達(dá)。在低于25歲的年輕成人的纖維環(huán)中沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，但是在老年人的髓核細(xì)胞中顯著增多。而且鈣依賴性磷脂酶A2(calcium-dependent phospholipase A2 PLA2)為前列腺素E2(prostaglandin E2 PGE2)生成的調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)在尸體標(biāo)本和外科標(biāo)本中被發(fā)現(xiàn)，并且中年患者的椎間盤的鈣依賴性磷脂酶A2的表達(dá)較高，相比于年輕的或年老的受試者，該現(xiàn)象表明鈣依賴性磷脂酶A2在維持自我動(dòng)態(tài)平衡方面具有重要的生理學(xué)作用[3]。像腫瘤壞死因子-α和鈣依賴性磷脂酶A2等許多其他的炎癥性關(guān)鍵介質(zhì)都局限于非退行性人類椎間盤組織。重要的是椎間盤本來(lái)的酶的活性被研究，這表明在完整的椎間盤中，IL-1為關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可介導(dǎo)椎間盤基質(zhì)變性，IL-1通過(guò)測(cè)量酶的活性來(lái)對(duì)抗明膠、膠原Ⅱ型和酪蛋白基質(zhì)(casein matrices)。而且在具有癥狀的退變性椎間盤中，MMP-10在mRNA和蛋白水平的表達(dá)呈增加狀態(tài)，與無(wú)癥狀的椎間盤比較，IL-1可能促進(jìn)基質(zhì)的降解和傷害感受性的起始。許多已經(jīng)鑒定的因子并不是在天然的椎間盤中的自發(fā)性生成，免疫反應(yīng)性因子如IL-4、IL-6、IL-12和干擾素-γ在進(jìn)行外科手術(shù)的椎間盤組織中呈中度表達(dá)，在脫出的椎間盤樣本中表達(dá)更高。而在對(duì)照組的非退行性椎間盤中卻不存在。早期研究在變性的椎間盤樣本中檢測(cè)到IL-1、細(xì)胞內(nèi)粘附因子-1(intracellular adhesion molecule-1 ICAM-1)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(lymphocyte function-associated antigen LFA)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor)的存在。對(duì)于某些免疫反應(yīng)性因子：IL-4、IL-6、IL-12、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α呈中度表達(dá)，但在脫出的退化性椎間盤中更為明顯，并且伴有實(shí)質(zhì)性的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。而且病理性椎間盤高度表達(dá)IL-17，表明Th17淋巴細(xì)胞在脫出椎間盤病變中涉及到，其他的研究已經(jīng)證明在脫出的椎間盤中有TNF-α、IL-Iβ、IL-6、IL-8、IL-20、PGE2和一氧化氮的高度表達(dá)。某些炎癥性關(guān)鍵介質(zhì)已經(jīng)被證明與人類的椎間盤疼痛相聯(lián)系。RANTES和IL-Iβ在疼痛性椎間盤組織中表達(dá)非常顯著，相比于無(wú)痛性椎間盤組織，與IL-6和IL-8的表達(dá)相反。在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor NGF)中一個(gè)非常明顯的不同被觀察到，神經(jīng)細(xì)絲-68生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(neurofilament -68 growth-associated protein GAP)-43和P物質(zhì)在被入侵的神經(jīng)纖維、在內(nèi)和環(huán)繞在非脫出椎間盤的外層中發(fā)現(xiàn)，與椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬的椎間盤相比較[4]。另一項(xiàng)研究評(píng)估，在人類髓核細(xì)胞中的91種細(xì)胞因子和趨化因子相關(guān)性基因，表明髓核細(xì)胞為IL-6、CCL2、CCL7和CXCL8的來(lái)源。某些促炎性細(xì)胞因子通常在人類退變性椎間盤中表達(dá)水平增加，例如IL-Iβ和TNF-α，可能介導(dǎo)分解代謝反應(yīng)減少，蛋白聚糖的生成和加強(qiáng)MMP的表達(dá)[5]。

雖然某些椎間盤退行性病變與炎癥介質(zhì)有聯(lián)系，且在體外研究中已經(jīng)得到鑒定。但是在體內(nèi)研究中還未完全明確，最近的證據(jù)將重點(diǎn)集中于幾種分子的作用，研究的主體在大鼠、兔子和豬類動(dòng)物模型中進(jìn)行。在椎間盤脫出的大鼠動(dòng)物模型中，髓核暴露可導(dǎo)致IL-6、TNF-α和TNF-γ水平的增加，其他細(xì)胞因子(IL-Iβ、IL-I0、IL-Iα和IL-I2)已經(jīng)在外科手術(shù)中增加，表達(dá)水平不再發(fā)生改變[6]。在另一項(xiàng)研究中，TNF-α在大鼠椎間盤脫出模型中的表達(dá)得到鑒定，TNF-α與根部疼痛相聯(lián)系。而且大鼠尾部環(huán)形切口的模型證明IL-Iβ在損傷后4天呈現(xiàn)短暫性高峰。這個(gè)模型以髓核體積減少為特征，環(huán)狀膠原層破裂、環(huán)形成纖維細(xì)胞組織化生成為軟骨樣細(xì)胞。然而TNF-α和IL-6的表達(dá)沒有觀察到顯著的變化。在家兔的腰椎環(huán)形切口模型中，IL-1α和TNF-α基因在全部的椎間盤中沒有觀察到發(fā)生變化，在損傷后的1周或3周內(nèi)。在相同的模型中，IL-1β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶在第3周后基因表達(dá)增加，但是在第6-12周表達(dá)水平下降，在24周形成第2個(gè)高峰，很可能顯示出長(zhǎng)期的促炎性作用[7]。在家兔的椎間盤脫出模型中，TNF-α、IL-1β和MCP-1。MCP-1被描述為一個(gè)有能力的巨噬細(xì)胞化趨化因子被進(jìn)行研究分析：TNF-α和IL-1β通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)在1天后被檢測(cè)到，隨后為MCP-1，損傷后3天檢測(cè)到。浸潤(rùn)細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞在3天后也被觀察到。有趣的是，豬腰椎環(huán)形切口模型的IL-8表達(dá)水平的顯著增加，并且觀察到伴隨著IL-1表達(dá)水平的下降，在椎間盤進(jìn)行椎間盤進(jìn)行椎間盤切除后的第12周，同時(shí)沒有在椎間盤形態(tài)、蛋白聚糖含量以及在IL-6和TNF-α的表達(dá)水平方面觀察到差異性，未處理組和損傷組的椎間盤之間[8]。然而IL-1和IL-8具有促炎癥特性，研究者建議椎間盤切除手術(shù)有可能刺激椎間盤修復(fù)反應(yīng)的開始，鑒于IL-8作為同化類激素藥的表達(dá)水平增加，當(dāng)分解代謝性的IL-1細(xì)胞因子表達(dá)水平降低時(shí)。

在椎間盤的骨生成方面，CTGF功能已經(jīng)被研究的非常廣泛。最近研究已經(jīng)說(shuō)明，CTGF在多種骨骼組織中顯示出實(shí)質(zhì)性功能，其在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及椎間盤和顱縫生長(zhǎng)之間中的作用被研究的比較集中。軟骨：軟骨成骨的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，間質(zhì)細(xì)胞聚集分化導(dǎo)致生長(zhǎng)平板軟骨細(xì)胞的形成，生長(zhǎng)平板軟骨細(xì)胞在生長(zhǎng)方面是以不同區(qū)域分布的，包括緩慢增殖儲(chǔ)備群體和快速增殖柱狀群體。伴隨著有絲分裂后肥大前區(qū)域和最后末端分化肥大區(qū)域。肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)隨后促進(jìn)血管侵入和成骨細(xì)胞遷移導(dǎo)致軟骨模板與骨的更換[9]。 CTGF不在間充質(zhì)聚集區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，但是在生長(zhǎng)板形成的早期階段可以檢測(cè)到。CTGF在增殖性軟骨細(xì)胞中以低水平表達(dá)，在肥大軟骨細(xì)胞中呈高水平表達(dá)。在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的表達(dá)已經(jīng)確定其在CTGF促進(jìn)中利用TCF/LEF功能域性通過(guò)經(jīng)典Wnt通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)解釋了CTGF在肥大軟骨細(xì)胞中的高水平表達(dá)的原因。在生長(zhǎng)板包含有高濃度的穩(wěn)定性β-連接蛋白(β-catenin)。 CTGF剔除小鼠在出生高死亡率，并伴隨著嚴(yán)重性軟骨發(fā)育不全。CCN-/-軟骨細(xì)胞顯示出增殖和存活比率的降低，包括Ⅱ型膠原和聚集蛋白(主要的膠原和蛋白聚糖)[10]。

本研究表明，椎間盤內(nèi)注射復(fù)方丹參注射液能夠有效抑制炎性因子TNF-α和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF的表達(dá)，對(duì)椎間盤退行性病變的進(jìn)展起到延緩作用。