高效液相色譜法測定毒氟磷原藥及可濕性粉劑中有效成分含量

佟盟露，丁玉玲，賈孫悅，馬騰飛，周 芹，3，4*，姜宜飛

(1.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學化學化工與材料學院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 哈爾濱 150080；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

引言

毒氟磷是一種新型α-氨基膦酸酯類殺菌劑，化學名稱為N-[2-(4-甲基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O，O-二乙基膦酸酯[1]，是一種新型高效的抗病毒制劑，能夠激活植物的系統(tǒng)性抗性(SAR)[2]。植物病毒是第二大類植物病害[3]，變異速度快，不斷出現(xiàn)新毒株[4]，具有危害大，難檢測以及難防治等特點[5]，因此，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極其嚴重的危害，為了防止植物病毒病的大規(guī)模爆發(fā)，貴州大學歷經(jīng)十年的研究，發(fā)現(xiàn)了具有全新結構的磷系抗植物病毒新農(nóng)藥-毒氟磷，并獲得農(nóng)業(yè)部新農(nóng)藥登記，成為具有完全自主知識產(chǎn)權的農(nóng)藥品種[6]。

毒氟磷具有主動防御，促進生長以及內吸作用等基本特性[7]，還可以調節(jié)植物的內源生長因子，恢復植物葉部功能及根部生長。對植物病毒也有很高的防治效果[8]，其中對黃瓜、煙草以及番茄病毒都有防治作用[9]，此外，毒氟磷對水稻黑條矮縮病等的防治效果也非常顯著，Li等[10]經(jīng)實驗表明，毒氟磷在體內和田間試驗中都能抑制水稻黑條矮縮病毒在水稻中的感染活性，與SRBSDV P9-1基因表達的抑制活性最高，且在體外與SRBSDV P9-1蛋白有微弱的親和力，最終證實毒氟磷與P9-1八聚體蛋白內孔中的精氨酸175結合而抑制SRBSDV的感染，具有良好的應用前景。

如今，農(nóng)藥的安全性問題被越來越多的人關注。毒氟磷作為一種新型的環(huán)保型抗病毒有機磷農(nóng)藥，被廣泛普及應用，但對毒氟磷的體內安全性評價非常有限[11]，且由于毒氟磷的高對映選擇性和高控制成本，導致毒氟磷的非手性分析以及殘留物測定仍沒得到充分的發(fā)展。鄭坤明等[12]采用高效液相色譜測定了大棚和露地條件下，西瓜中毒氟磷的殘留量在0.01～5.0mg/kg添加水平下，毒氟磷平均回收率分別為84.5%～103.9%，RSD為1.2%～7.5%，方法的精密度和準確度良好。焦斌等[13]建立了土壤中毒氟磷殘留的檢測方法，采用QuEChERS前處理，應用高效液相色譜串聯(lián)質譜進行樣品檢測，在準確度、靈敏度和精密度上均滿足殘留分析要求，可以為毒氟磷在中國典型土壤中的殘留檢測提供方法支撐。目前的研究報道多數(shù)是關于毒氟磷在植株，土壤及水體中的殘留問題，毒氟磷制劑有效成分檢測方面的報道比較少，不少企業(yè)為了降低農(nóng)藥成本，提高農(nóng)藥防治效果，在產(chǎn)品中添加非法成分[14]，隱性添加不易察覺，尚未建立系統(tǒng)的農(nóng)藥成分監(jiān)管方法[15]，陳書華等[16]在市場抽檢的生物農(nóng)藥樣品中，禁限用農(nóng)藥成分檢出率高達42.9%，農(nóng)藥添加未經(jīng)登記的農(nóng)藥成分已經(jīng)影響了農(nóng)藥質量安全。因此，對農(nóng)藥制劑有效成分的檢測非常必要，本實驗擬建立一種方法可以同時適用于毒氟磷原藥(technical material簡寫為TC)及可濕性粉劑(water power簡寫為WP)中有效成分的測定。采用反相高效液相色譜法，通過波長掃描確定最適宜的檢測波長，特異性檢驗確定峰純度，優(yōu)化了流動相比例，建立的方法完全滿足上述要求，具有靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點，同時為國家標準的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器)；色譜柱為250 mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內裝 ZORBAX SB-C18、粒徑為5μm；針式過濾器(配有孔徑為0.45μm的濾膜)；50μL微量進樣器；5μL定量進樣管；超聲波清洗器。

1.1.2 實驗試劑 色譜純甲醇；新蒸二次蒸餾水或超純水；已知質量分數(shù)為99.1%的毒氟磷標樣。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 流動相：Ψ(甲醇：水)=80：20，經(jīng)濾膜過濾，并進行脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃±2 ℃；檢測波長：270 nm；進樣體積：5μL。

1.2.2 測定步驟

醫(yī)院門診大廳有一塊區(qū)域是門診服務中心，有大量自助服務設備，提供建檔、預約、掛號、查詢、充值等自助服務，涵蓋患者就診全流程。這只是醫(yī)院自助機總量的一部分，鈕羅涌介紹，全院不同角落分布著150多臺自助服務機。

1.2.2.1 標準溶液的制備 將0.05g(需要精確到0.000 1g)毒氟磷標樣，放入體積為100mL的容量瓶中，加入一定體積的甲醇，使用超聲波清洗器進行超聲，超聲的時間是5～10min，將其冷卻到室溫，最終用甲醇稀釋定容至刻度線，搖勻備用。

1.2.2.2 試樣溶液的制備 將含有0.05g(需要精確到0.000 1g)毒氟磷的試樣，放入體積為100mL的容量瓶中，加入一定體積的甲醇，使用超聲波清洗器進行超聲，超聲的時間是5～10 min，將其冷卻到室溫，最終用甲醇稀釋定容到刻度線，搖晃均勻，過濾備用。

1.2.2.3 測定 在這個操作條件之下，等到儀器穩(wěn)定之后，將多針標樣溶液連續(xù)注入進去，直到毒氟磷相鄰2針的峰面積之間的相對變化<1.2%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 吸收波長的選擇 毒氟磷結構中含有共軛雙鍵，在紫外區(qū)會有吸收，為了確定毒氟磷最適宜的吸收波長，利用高效液相色譜配制的二極管陣列檢測器，對毒氟磷溶液進行掃描，波長范圍是190～400nm(圖1是毒氟磷的紫外光譜圖)，圖中可見，毒氟磷在227nm處有最大的吸收波長，在270nm處也有較強吸收，用這2個最大吸收波長對毒氟磷進行檢測，結果表明，雖然在227nm處靈敏度更高，但是基線的平衡時間過長，而且在227nm處一些雜質會有紫外吸收，因此，為了檢測減少其他雜質對毒氟磷的干擾，確定其檢測波長為270 nm[17]。

圖1 毒氟磷的紫外光譜圖

2.1.2 色譜柱及流動相的選擇 通常而言，流動相的比例配制以及流速的設置都對復雜樣品的分離有著很大的影響，因此，實驗前必須要優(yōu)化流動相配比，本實驗選擇的色譜柱是反相色譜柱，內裝ZORBAX SB-C18。根據(jù)毒氟磷物理和化學性質以及溶劑的紫外吸收波長，用甲醇來溶解樣品，流動相用甲醇和水，對不同比例的甲醇/水體系進行比較，選擇最適的流動相比例。結果發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的增加，保留時間逐漸減小，出峰時間過早，會有一些雜質干擾；而如果水含量過高，保留時間過長，峰形較寬，拖尾，而且靈敏度也會隨之降低，因此，最終選擇的流動相是Ψ(甲醇：水)=80 ：20，以1.0mL/min為流速。在這個條件下，能夠呈現(xiàn)出較好的峰形，而且能夠徹底與其他物質分開，精密度和準確度良好，并且在10min之內就可以達到基線分離，分析時間較短，提高了工作效率。在優(yōu)化的流動相比例及檢測波長條件下，毒氟磷出峰時間大約在8.1min(圖2～圖4毒氟磷標準品、原藥及可濕性粉劑的液相色譜圖)。

2.2 峰純度檢驗 一個分析方法建立后，需要對其專屬性進行驗證[18]，峰純度(Peak purity)檢查越來越多的被用于評價方法專屬性，可以提供峰純度的檢測器有二極管陣列檢測器(DAD)、質譜(MS)及多通道紫外可見光檢測器等等。峰純度成為是否能夠準確分析的重要因素[19]。本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法對毒氟磷進行鑒別，30%毒氟磷可濕性粉劑以及98%毒氟磷原藥中的毒氟磷的峰純度因子全部都>990，有效成分處沒有被其他雜質所干擾，符合標準(圖5～圖6)。

保留時間/min圖2 毒氟磷標準品的的液相色譜圖

保留時間/min圖3 毒氟磷原藥液相色譜圖

保留時間/min圖4 毒氟磷可濕性粉劑液相色譜圖

圖5 98%毒氟磷原藥HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖6 30%毒氟磷可濕性粉劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法學考察

圖7 毒氟磷峰面積與質量濃度關系圖

2.3.2方法精密度試驗 精密度為同一標準樣品多次測定的變異系數(shù)[20]，通常用偏差，標準偏差以及相對標準偏差來表示。本實驗對同一樣品進行5次測定，計算結果的標準偏差以及相對標準偏差。按照1.2.2試樣溶液的制備方法，分別配制5個98%毒氟磷原藥精密度溶液，標記為TC-A1至TC-A5。5個30%毒氟磷可濕性粉劑精密度溶液，從WP-A1到WP-A5依次進行標記。將STD3作為標液，按照以上的操作條件，待儀器基線穩(wěn)定后，在標樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標樣溶液的順序下，依次進行測定，結果(表1、表2)。

表1 98%毒氟磷原藥中毒氟磷精密度試驗結果

表2 30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷精密度試驗結果

實驗結果表明，98%毒氟磷原藥中毒氟磷質量分數(shù)測定結果的RSD為1.23%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.35(C=0.934 0)，30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷質量分數(shù)測定結果的RSD為1.61%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.62，(其中C=0.282 2)，測定出的精密度符合標準。

2.3.3 方法準確度試驗 稱取含0.025g(精確至0.000 1g)毒氟磷的30%毒氟磷可濕性粉劑于放入體積為100mL容量瓶中，再加入0.025g(精確至0.000 1g)的毒氟磷標樣，同1.2.2的方法對溶液進行配置，選擇5個有效成分準確度溶液，從WP-B1到WP-B5依次進行標記。將線性相關溶液STD3作為標樣溶液，待儀器基線穩(wěn)定后，在標樣溶液、準確度溶液、準確度溶液、標樣溶液的順序下，依次進行測定，結果(表3)。實驗結果表明，30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷平均回收率為99.43%，具有良好的準確度。

表3 30%毒氟磷可濕性粉劑回收率試驗結果

2.3.4 不同實驗室方法驗證 為了驗證所建立的能夠同時適用于98%毒氟磷原藥和30%毒氟磷可濕性粉劑中有效成分檢測方法能夠適用于每一個不同的實驗室，因此按照已經(jīng)建立好的方法，對4個不同的實驗室進行協(xié)同驗證試驗。每組4家單位在2個不同日期對樣品含量進行重復測定，分別計算試樣1和試樣2的結果，每個樣品2個不同日期測定得到4個結果，(表4、表5)。

表4 98%毒氟磷原藥協(xié)同驗證試驗結果

表5 30%毒氟磷可濕性粉劑協(xié)同驗證試驗結果

結果表明，98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑的重復性相對標準偏差RSDr分別為0.562 7%、0.557 3%，再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR分別為0.733 9%、0.816 2%，都小于相應的Horwitz公式2(1-0.51ogC)理論計算值，表明不同單位間的檢測結果符合性良好，所建立的毒氟磷液相色譜分析方法能夠解決日常檢測工作的需求，結果(表6)。

表6 不同實驗室方法驗證結果統(tǒng)計表

3 討論

高效液相色譜擁有諸多優(yōu)點，方便快捷，具有較高的準確性，可以檢測到微量成分，因此被廣泛使用，然而目前的研究結果主要集中于毒氟磷殘留的檢測方面，而對于農(nóng)藥制劑有效成分等方面的研究內容相對較少，且多數(shù)研究結果都只建立了測定一種試劑有效成分的高效液相色譜分析方法，如葛家成等[21]建立了一種測定氟氯蟲雙酰胺懸浮劑有效成分的高效液相色譜分析方法，王睿等[22]建立一種對40%環(huán)丙唑醇懸浮劑進行分離和測定的高效液相色譜分析方法，而本研究能夠同時測定98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑中有效成分含量的高效液相色譜分析方法。

本試驗還按照已經(jīng)建立好的方法，對4個不同的實驗室進行協(xié)同驗證試驗，數(shù)據(jù)表明，不同單位間的檢測結果符合性良好，充分滿足日常檢測工作的需要。

4 結論

本研究建立的毒氟磷測定方法，98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑相對標準偏差(RSD)分別為1.23%和1.61%；30%毒氟磷可濕性粉劑的回收率為99.43%，不同實驗室不同儀器之間的重復性標準偏差(RSDr)分別為0.562 7%和0.557 3%，再現(xiàn)性相對標準偏差(RSDR)分別為0.733 9%、0.816 2%。該方法能夠獲得較高的精密度和準確度，且線性關系良好，能夠滿足毒氟磷含量分析的要求，操作簡單，快捷，為98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑質量控制提供了一種可行的方法。